水通道4在神經(jīng)病理性疼痛中的作用及可能機(jī)制.pdf

1、國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)將神經(jīng)病理性疼痛定義為在外周或中樞水平由軀體感覺(jué)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的疼痛。神經(jīng)病理性疼痛嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,治療困難,給社會(huì)帶來(lái)巨大的衛(wèi)生資源壓力和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚未完全闡明。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制已進(jìn)行了大量研究并取得了一定的進(jìn)展。目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生及維持涉及神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性,包括外周及中樞機(jī)制,但是確切機(jī)制尚未闡明。越來(lái)越多的證據(jù)表明

2、,包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的脊髓膠質(zhì)細(xì)胞在慢性疼痛特別是神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展、維持過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,因此研究和發(fā)現(xiàn)影響膠質(zhì)細(xì)胞激活的分子對(duì)于解釋神經(jīng)病理性疼痛的生物學(xué)機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)靶點(diǎn)和治療措施具有十分重要的意義。
　　水通道4(aquaporin 4,AQP4)是參與水轉(zhuǎn)運(yùn)的水通道家族中的一員,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最豐富的水通道。在腦內(nèi)AQP4呈典型的極性分布,主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞與血管相連的終足上,同

3、時(shí)在室管膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上也有表達(dá);在神經(jīng)元中幾乎不表達(dá);在靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞上不表達(dá),激活態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞上是否表達(dá)尚存在爭(zhēng)議。在脊髓中,AQP4主要分布于圍繞興奮性和抑制性突觸結(jié)構(gòu)的星形膠質(zhì)細(xì)胞突起部位,提示其可能參與突觸傳遞功能。AQP4在脊髓背角中的分布從淺層到深層逐漸降低,在背角淺層(I、II層)表達(dá)最高,提示可能與脊髓背角淺層的功能密切相關(guān)。文獻(xiàn)調(diào)研顯示,AQP4是星形膠質(zhì)細(xì)胞上最重要的水通道,能夠影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)

4、構(gòu)和細(xì)胞間隙連接;能夠調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能,影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移、增殖以及瘢痕的形成。此外,AQP4與鉀通道4.1(Kir4.1)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glutamate transporter 1,GLT1)共存于星形膠質(zhì)細(xì)胞中,在功能上存在偶聯(lián),對(duì)于細(xì)胞外K+穩(wěn)態(tài)的維持以及突觸間隙谷氨酸的清除非常重要。AQP4還通過(guò)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能,包括調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性、多巴胺(dopamine,DA)、谷氨酸(gluta

5、mate,Glu)等神經(jīng)遞質(zhì)的含量及釋放和某些病理?xiàng)l件下神經(jīng)元存活和神經(jīng)再生,但詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。近年來(lái)大量研究報(bào)道星形膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)病理性疼痛。最近研究顯示,損傷、缺血誘發(fā)的腦內(nèi)AQP4表達(dá)上調(diào)與星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表達(dá)上調(diào)相平行,而下調(diào)AQP4表達(dá)則影響堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖;AQP4基因敲除能夠降低腦內(nèi)

6、注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)引起的神經(jīng)炎癥,也能夠降低培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中LPS刺激的前炎性細(xì)胞因子的釋放。以上研究提示,AQP4可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能密切相關(guān),但是AQP4是否參與神經(jīng)病理性疼痛目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本課題的目的是研究AQP4在神經(jīng)病理性疼痛中的作用及可能機(jī)制。
　　本課題的研究?jī)?nèi)容主要包括以下三部分:第一部分,在小鼠急性疼痛模型和大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中給予AQP4非選擇性抑制劑

7、乙酰唑胺(acetazolamide,AZA),初步研究AQP4在急性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛中的作用。結(jié)合本課題組在AQP4基因敲除動(dòng)物中的研究結(jié)果,在明確了AQP4在神經(jīng)病理性疼痛中的作用后,第二部分,應(yīng)用野生型和AQP4基因敲除小鼠構(gòu)建坐骨神經(jīng)分支損傷模型(spared nerve injury,SNI)模型,研究神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中脊髓AQP4表達(dá)的時(shí)程特征及其與星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)系。明確AQP4與膠質(zhì)細(xì)胞激

8、活的關(guān)系后,第三部分研究哪些刺激膠質(zhì)細(xì)胞激活的因素依賴(lài)于AQP4,即在細(xì)胞水平從膠質(zhì)細(xì)胞激活方面探討AQP4影響了哪些刺激膠質(zhì)細(xì)胞激活的因素。通過(guò)以上研究,探討AQP4參與神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制。具體研究結(jié)果如下:
　　一、AQP4非選擇性抑制劑乙酰唑胺對(duì)急性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛的作用:AQP4非選擇性抑制劑AZA對(duì)熱刺激(熱輻射甩尾和熱板模型)誘發(fā)的小鼠急性疼痛無(wú)顯著影響,但是AZA可劑量依賴(lài)的減輕大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(

9、chronic constriction injury,CCI)模型機(jī)械刺激痛覺(jué)超敏。本課題組尚未發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AQP4基因敲除對(duì)熱刺激(熱板和熱輻射甩尾模型)、化學(xué)刺激(福爾馬林和辣椒素致痛模型)和機(jī)械刺激(von Frey hair模型)誘發(fā)的急性疼痛均無(wú)影響,但是能顯著減輕神經(jīng)病理性疼痛誘發(fā)的機(jī)械刺激痛覺(jué)超敏。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AQP4不影響急性疼痛,可能參與神經(jīng)病理性疼痛。
　　二、在神經(jīng)病理性疼痛中AQP4表達(dá)的時(shí)程特

10、征及其與膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)系:行為學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示,在小鼠SNI模型中,從術(shù)后1d到術(shù)后28d,AQP4基因敲除(knockout,KO)小鼠與野生型(wild-type,WT)小鼠相比機(jī)械刺激痛覺(jué)超敏的程度顯著減輕,提示AQP4在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮了作用。在此模型中,我們研究了脊髓中的AQP4在神經(jīng)病理性疼痛中表達(dá)的時(shí)程特征及其與膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)系。蛋白免疫印跡分析結(jié)果顯示,在WT小鼠中,與假手術(shù)組相比,SNI手術(shù)組小鼠脊髓(L4-L6

11、節(jié)段)中AQP4的表達(dá)在術(shù)后1d和3d無(wú)顯著變化,而在術(shù)后7d開(kāi)始出現(xiàn)顯著升高,該現(xiàn)象至少持續(xù)至術(shù)后28d;GFAP(星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物,其表達(dá)上調(diào)反映了星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活)的表達(dá)和表達(dá)的時(shí)程改變與AQP4完全一致;簇分化抗原11b(Cluster differentiation antigen 11b,CD11b,小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物,其表達(dá)上調(diào)反映了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活)的表達(dá)則在術(shù)后1d就出現(xiàn)明顯升高并持續(xù)至術(shù)后7d,之后開(kāi)始降

12、低,術(shù)后28d時(shí)已恢復(fù)至正常水平。在AQP4KO小鼠中,與假手術(shù)組相比,SNI手術(shù)組小鼠脊髓中GFAP的表達(dá)在術(shù)后1d到術(shù)后28d均未出現(xiàn)明顯改變;CD11b的表達(dá)在術(shù)后1d和3d未出現(xiàn)顯著性升高。術(shù)后7d開(kāi)始降低,術(shù)后14d時(shí)已恢復(fù)至正常水平。這些結(jié)果提示,在神經(jīng)病理性疼痛早期,AQP4的表達(dá)沒(méi)有改變,星形膠質(zhì)細(xì)胞也沒(méi)有激活,但此時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)激活;而在神經(jīng)病理性疼痛中晚期,AQP4表達(dá)增強(qiáng),此時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞也處于激活狀態(tài),但小膠質(zhì)

13、細(xì)胞的激活開(kāi)始降低并恢復(fù)至正常水平。以上結(jié)果說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和AQP4的表達(dá)升高具有相關(guān)性,而小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和AQP4的表達(dá)升高的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。因此,AQP4基因敲除減輕神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制可能與其抑制脊髓中星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活有關(guān)。
　　在神經(jīng)病理性疼痛中,激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均能夠釋放前炎性細(xì)胞因子,如白介素1beta(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,

14、IL-6)和腫瘤壞死因子alpha(tumor necrosis factor-α,TNF-α),這些因子反映了膠質(zhì)細(xì)胞激活后的功能變化。在WT小鼠中,與假手術(shù)組相比,SNI手術(shù)組小鼠脊髓(L4-L6節(jié)段)中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量在術(shù)后1、3、7、14和28d均顯著升高,與膠質(zhì)細(xì)胞的激活相一致;在AQP4KO小鼠中,與假手術(shù)組相比,SNI手術(shù)組小鼠脊髓中上述3種因子的含量在術(shù)后1d和3d未出現(xiàn)顯著性升高,從術(shù)后7d開(kāi)始3

15、種因子的含量恢復(fù)至正常水平。結(jié)果提示,在神經(jīng)病理性疼痛早期,3種因子的來(lái)源主要是激活的小膠質(zhì)細(xì)胞;而在神經(jīng)病理性疼痛中晚期,3種因子的來(lái)源主要是激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞。因此,在神經(jīng)病理性疼痛中晚期,AQP4基因敲除能夠降低脊髓中前炎性細(xì)胞因子的含量。
　　綜上所述,本部分研究發(fā)現(xiàn)AQP4基因敲除減輕神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)制可能與其抑制脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活、降低前炎性細(xì)胞因子的含量有關(guān);與小膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系有待進(jìn)一步有研究。
　　三、

16、AQP4對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)及機(jī)制:本課題的第二部分在整體水平上觀察到了AQP4與星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的關(guān)系,而AQP4又表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞上,那么AQP4是否直接影響了星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活?因此本部分研究用體外實(shí)驗(yàn)來(lái)回答這個(gè)問(wèn)題。神經(jīng)病理性疼痛中(如SNI模型),前炎性細(xì)胞因子和致痛遞質(zhì)是兩個(gè)很重要的引起膠質(zhì)細(xì)胞激活的刺激因素,在本部分的研究中,用LPS刺激膠質(zhì)細(xì)胞模擬前炎性細(xì)胞因子引起的膠質(zhì)細(xì)胞的激活,用谷氨酸(glutamic acid

17、,Glu)刺激膠質(zhì)細(xì)胞是致痛遞質(zhì)導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞激活的刺激因素。在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞模型上,通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS(100ng/ml)能夠激活體外培養(yǎng)的大鼠乳鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞;而AQP4非選擇性抑制劑AZA(0.1μM、0.3μM、1μM、3μM和10μM)可以劑量依賴(lài)的抑制LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。此外,LPS(100ng/ml)可以引起AQP4表達(dá)陽(yáng)性的WT乳鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活,而不引起AQP4表達(dá)陰性的KO乳鼠脊

18、髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活依賴(lài)于AQP4的存在。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Glu(10μM、100μM和1mM)能夠激活體外培養(yǎng)的大鼠乳鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞;而AZA(10μM)可以抑制上述3個(gè)濃度的Glu誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。此外,Glu(1mM)可以引起AQP4表達(dá)陽(yáng)性的WT乳鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活,而不引起AQP4表達(dá)陰性的KO乳鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Glu誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活