Genistein對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 探討genistein對氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)活化的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中一氧化氮合酶(eNOS)表達(dá)的影響。
　　 方法：
　　 1.研究genistein長時(shí)間干預(yù)的作用:
　　 (1)體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，在ox-LDL(lOOmg/L)干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，不同濃度的genistein(10nmol/L,50nmol/L，100nmol/L)孵育24h，MT

2、T法檢測HUVECs細(xì)胞活力的變化，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( RT-PCR)和Western blot觀察genistein對eNOS表達(dá)的影響。
　　 (2)經(jīng)雌激素受體拮抗劑ICI182780(1μ M)或經(jīng)基因轉(zhuǎn)錄阻斷劑-放線菌素D(5mg/L)作用30min，再加入genistein(100nmol/L)作用24h，RT-PCR和Western blot檢測eNOS的表達(dá)。
　　 2.研究genistein短時(shí)間干

3、預(yù)的作用:體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，在ox-LDL(100mg/L)干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，genistein(100nmol/L)分別作用5、10、15、30和60min，Greiss反應(yīng)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中一氧化氮(NO)的含量，RT-PCR檢測HUVECs eNOS mRNA的表達(dá)，Western blot檢測HUVECs eNOS蛋白和磷酸化eNOS( Ser1177)的表達(dá)水平；同時(shí)，Westem blot觀察PI3K/AKT信號

4、通路抑制劑LY294002和NSC154020干預(yù)后，genistein對HUVECs磷酸化eNOS(Ser1177)表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 l.genistein長時(shí)間干預(yù)的作用:
　　 (1)MTT結(jié)果顯示:ox-LDL(100mg/L)組細(xì)胞活力明顯受到抑制(P＜0.05)，而genistein則明顯增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力，隨著genistein濃度的升高(10nmol/L,50nmol/L，100

5、nmol/L)，細(xì)胞活力升高越顯著(P＜0.05)。
　　 (2)RT-PCR和Westem blot結(jié)果顯示:與JT常對照組相比，ox-LDL(lOOmg/L)組明顯下調(diào)eNOS mRNA和蛋白表達(dá)(P＜0.05)，而genistein明顯上調(diào)eNOS mRNA和蛋白表達(dá)(P＜0.05)；genistein對eNOS的誘導(dǎo)作用被雌激素受體拮抗劑ICI182780(1μ M)和基因轉(zhuǎn)錄阻斷劑一放線菌素D(5mg/L)明顯的抑制(

6、P＜0.05)，
　　 2.genistein短時(shí)間干預(yù)的作用:HUVECs經(jīng)100nmol/L genistein短時(shí)間(5、10、15、30和60min)處理后，培養(yǎng)液NO濃度和磷酸化eNOS(ser1177)表達(dá)水平均明顯高于ox-LDL組(P均＜0.05)，其中g(shù)enistein15min處理組作用最明顯，然而，eNOS mRNA和非磷酸化eNOS蛋白表達(dá)水平與ox-LDL組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；同時(shí)，HUV

7、ECs經(jīng)P13K/AKT信號通路抑制劑LY294002和NSC154020干預(yù)后，磷酸化eNOS(Ser1177)表達(dá)明顯低于genistein處理組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)genistein作用時(shí)間比較長(24h)時(shí)，通過促進(jìn)eNOS表達(dá)，進(jìn)而提高eNOS的活性，這個(gè)過程和雌激素受體介導(dǎo)的基因組途徑密切相關(guān)。
　　 (2) genistein作用時(shí)間比較短(60min以內(nèi))時(shí)，genist