托吡酯對大鼠腦局灶性缺血再灌注損傷的保護作用研究.pdf

1、背景和目的 腦卒中是目前人類疾病的三大死亡原因之一，是導致成人殘疾的最常見原因。腦缺血發(fā)生后，腦組織存在著復雜的病理生理過程，包括腦血流中斷及低灌注、能量耗竭、血流再通后的再灌注損傷、自由基反應、興奮性氨基酸毒性及鈣超載等，將導致神經(jīng)元變性壞死，遲發(fā)性神經(jīng)元死亡和/或凋亡，而神經(jīng)保護劑的應用可減少由缺血帶來的一系列病理損傷，是目前研究的熱點。 近年來的研究表明，腦缺血時γ-氨基丁酸/谷氨酸(γ-aminobutydc a

2、cid GABA，glutamate Glu)比值進行性下降造成興奮—抑制失衡是導致缺血性損傷的重要原因之一，GABA是中樞內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元損傷中與主要的興奮性遞質(zhì)谷氨酸相抗衡，介導GABA中樞效應的受體至少有3種不同類型，其中GABAa受體分布最廣泛，并在缺血性腦損傷的神經(jīng)保護中占主導地位。在Glu的興奮性毒性中N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartat NMDA)起重要作用,NMDA受體過度

3、興奮介導的Ca<'2+>內(nèi)流，引起神經(jīng)細胞遲發(fā)性損傷在興奮毒性的病理中占主導地位。NMDARl是NMDA受體復合物的必需功能亞單位，在介導NMDA中樞效應中起著重要作用。 目前，人們注意到，被廣泛應用的抗癲癇藥具有一定的腦保護作用，其機理可能是通過減少興奮傳遞或增強神經(jīng)元抑制來抵消異常的腦興奮性。托吡酯(topiramateTPM)是一種具有多重藥理機制的新型抗癲癇藥物，它的作用機制包括增強GABA介導的抑制作用；阻滯Ca<'2

4、+>、Na<'+>通道，作用于非NMDA受體拮抗谷氨酸的興奮毒作用等，其在抗癲癇的使用上取得了較滿意的效果，但在缺血性腦損傷保護方面的研究尚少。研究托吡酯對缺血性腦損傷的保護作用及其機制有較重要的意義，可為其作為神經(jīng)保護劑的臨床應用提供理論依據(jù)。本研究通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，檢測再灌注后大鼠腦組織缺血區(qū)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)(GABA，Glu)含量，梗死半球的NMDARl．GABAa．受體陽性細胞表達的變化；光鏡下觀察細胞壞死情況

5、變化，同時應用托吡酯進行干預，探討托吡酯的神經(jīng)保護作用及作用機制，以開拓腦梗塞治療的新措施，并為以后臨床上應用托吡酯治療腦梗塞提供理論依據(jù)。 材料方法 1．動物分組：健康雄性SD大鼠92只，體重280～320克，由鄭州大學實驗動物中心提供。隨機分為4組：A：假手術組18只；B：單純?nèi)毖M18只； C：托吡酯治療組18只；D：托吡酯預防組18只。 2．動物處理：模型的制作：線栓法建立大鼠大腦中動脈(middle c

6、erebral arteryocclusion MCAO)閉塞模型，按Kuge Y等報告的方法稍加改進。B，C、D組大鼠制成MCAO模型假手術組除不將尼龍線插入頸內(nèi)動脈外，余同手術組。A組：進行假手術處理，24h時生理鹽水10ml/kg灌胃。B組：于拔線再灌注時生理鹽水10ml/kg灌胃。C組：于拔線再灌注時用新鮮配制成的TPM混懸液(10mf/ml，100mg/kg)灌胃。D組：于腦缺血再灌注術前3 d開始給藥，劑量為100 mg/k

7、g灌胃，每天一次，末次給藥30min后行腦缺血再灌注手術。 3．標本的制作：大鼠再灌注24h后，每組大鼠隨機取出6只，斷頭，快速于冰盤上分離右側(cè)額頂葉皮層組織，稱重，按1：10加入HClO<,4>(0.4mol/L)，用組織勻漿器冰浴勻漿1.5min，冰浴沉淀30min，離心(12000轉(zhuǎn)/分，20min，4<'0>C)后，吸取上清液分裝，于-70<'0>C冰箱保存，待測GABA,Glu含量。余下的各組大鼠經(jīng)心臟灌注固定后做石蠟

8、切片，供HE染色或做免疫組化用。 4．觀察指標： (1)缺血再灌注24h時進行神經(jīng)功能評分，按Zausinger 6分法進行神經(jīng)功能評分。 (2)HE染色：光鏡下觀察腦組織的病理變化。 (3)用SP免疫組化法觀察NMDARl及GABAa的表達情況。 (4) 高效液相色譜分析儀測腦組織內(nèi)GABA，Glu的含量5．統(tǒng)計方法：應用$PSS10.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)士標準差(x±s

9、)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗，取α=0.05作為顯著性檢驗標準。結果1．神經(jīng)功能評分：假手術組無神經(jīng)功能缺損，0分；單純?nèi)毖M神經(jīng)功能評分為2.97+0.94；托吡酯治療組神經(jīng)行為學評分為1.98+0.76；托吡酯預防組神經(jīng)行為學評分為1.32±0.48；單純?nèi)毖M與假手術組相比，神經(jīng)行為學評分有明顯差異(P<0.01)托吡酯治療組與單純?nèi)毖M相比，神經(jīng)行為學評分有差異(P<0.05)，托吡酯預防組與單

10、純?nèi)毖M相比，神經(jīng)行為學評分有明顯差異(P<0.01)。 2．HE染色：光鏡下假手術組偶有神經(jīng)元細胞變性、死亡，大部分細胞形態(tài)正常；單純?nèi)毖M可見大量神經(jīng)元細胞變性、死亡，核濃縮，空泡變性。托吡酯治療組梗死灶內(nèi)的神經(jīng)細胞變性壞死，細胞周圍明顯水腫，組織結構疏松，死亡細胞較單純?nèi)毖M明顯減少，托吡酯預防組神經(jīng)元細胞變性、死亡現(xiàn)象較托吡酯治療組減少。 3．大鼠腦皮層組織Glu含量：假手術組86.36±7.01uM/L；單純?nèi)?/p>

11、血組105.87+20.70uM/L；托吡酯治療組75.31±9.87uM/L；托吡酯預防組63.29±7.08。大鼠腦皮層組織GABA含量：假手術組5.57+0.36 uM/L；單純?nèi)毖俟嘧⒔M8.61±1.98uM/L；托吡酯治療組11.87±2.41uM/L；托吡酯預用藥組13.91±2.29 uM/L。單純?nèi)毖M大鼠缺血區(qū)腦皮層組織中興奮性氨基酸Glu，抑制性氨基酸GABA均升高(均P<0.05)。托吡酯治療組Glu含量較單純?nèi)?/p>

12、血組降低(P<0.05)，GABA含量與單純?nèi)毖M相比增多(P<0.05)。托吡酯預防組Glu含量較單純?nèi)毖M明顯降低(P<0.01)，GABA含量與單純?nèi)毖傧啾让黠@增多(P<0.01)。 4．大鼠腦缺血側(cè)腦組織GABAa免疫陽性細胞數(shù)：假手術組58.16±1.72；單純?nèi)毖俟嘧⒔M19.67±2.80；托吡酯治療組31.50±1.38；托吡酯預用藥組38.67±1.63。單純?nèi)毖俟嘧⒔M與假手術組相比大鼠腦缺血側(cè)腦組織GAB

13、Aa明顯降低(P<0.01)，托吡酯治療組較單純?nèi)毖MGABAa增高(P<0.05)。托吡酯預防組GABAa含量較單純?nèi)毖俟嘧⒔M明顯增高(P<0.01)。大鼠腦缺血側(cè)腦組織NMDAR1免疫陽性細胞數(shù)：假手術組35.50±1.38；單純?nèi)毖俟嘧⒔M25.33±2.25；托吡酯治療組16.00±2.09;托吡酯預防組10.67±1.03，單純?nèi)毖M與假手術組相比大鼠腦缺血側(cè)腦組織NMDAR1明顯降低(P<0.01)，托吡酯治療組較單純?nèi)毖?/p>

14、組NMDARl受體量降低(P<0.05)，托吡酯預防藥組NMDAR1受體量與單純?nèi)毖俟嘧⒔M相比明顯降低(P<0.01)。 結論 1、托吡酯對大鼠的腦缺血再灌注損傷具有保護和治療作用。 2、托吡酯的腦保護作用與其應用時間有關，治療性應用托吡酯的腦保護作用弱，預防性應用托吡酯的腦保護作用強。 3、托吡酯的保護大鼠腦缺血的的重要機制之一可能是通過抑制興奮性氨基酸釋放、提高抑制性氨基酸釋放及改變其受體表達實現(xiàn)的