老年性癡呆大鼠海馬突觸體的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的： 以老年性癡呆（Alzheimer's disease，AD）大鼠為研究對象，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法從海馬突觸體及血清中篩選與AD密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，為研究AD的發(fā)病機制提供理論支持。 方法： 1.動物分組及AD大鼠模型制備. 雄性SD大鼠24只，3月齡，體重250-300g，隨機分為兩組，其中正常對照組8只，制備AD模型組16只。在模型組大鼠海馬CA1區(qū)注射5μl Aβ1-40（濃度為1μg/μl）制備

2、AD模型。 2.AD大鼠模型Morris水迷宮記憶行為學(xué)篩選 通過Morris水迷宮4天的定位航行實驗和1天的空間探索實驗，評估模型組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，篩選出符合癡呆標(biāo)準(zhǔn)的AD大鼠模型8只。 3.分別制備兩組大鼠的血清樣本和海馬突觸體樣本，測定蛋白質(zhì)濃度. 收集AD組大鼠及正常對照組大鼠的血清，然后通過蔗糖密度梯度離心分離大鼠海馬突觸體。分別將AD組8只大鼠血清及正常組8只大鼠血清混合，制備AD組和

3、正常組大鼠血清樣本；將AD組8只大鼠海馬突觸體及正常組8只大鼠海馬突觸體混合，制備兩組大鼠的海馬突觸體樣本。然后將AD組與正常組大鼠血清樣本去除高豐度白蛋白及免疫球蛋白、除鹽濃縮并用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度；同時將AD組與正常組大鼠海馬突觸體樣本除鹽濃縮并測定蛋白質(zhì)濃度。 4.血清及海馬突觸體樣本的雙向凝膠電泳及差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析. 對AD組大鼠血清、正常組大鼠血清及AD組大鼠海馬突觸體與正常組大鼠海馬突觸體共

4、4種樣本分別進行雙向凝膠電泳，挑選AD與正常樣本的差異蛋白質(zhì)點進行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖。 5.數(shù)據(jù)庫查詢. 將MALDI-TOF-MS肽指紋圖譜分析得到的數(shù)據(jù)，在SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫中利用MASCOT Peptide Mass Fingerprint查詢軟件搜索并鑒定差異蛋白質(zhì)，從中找出與AD有關(guān)的血清蛋白質(zhì)和海馬突觸體蛋白質(zhì)。 結(jié)果：

5、1.兩組大鼠海馬突觸體的雙向凝膠電泳及差異蛋白質(zhì)的鑒定. 比較AD大鼠與正常大鼠海馬突觸體兩種樣本的雙向凝膠電泳圖譜，AD海馬突觸體樣本中有12個蛋白表達下調(diào)，選取其中3個差異最為明顯的蛋白（蛋白濃度相差3倍以上）進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜分析得到數(shù)據(jù)在SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫中搜索查詢，發(fā)現(xiàn)并鑒定出這3個蛋白分別為：α-2球蛋白鏈，肽酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶A（PPIase A），cofilin-1。

6、 2.兩組大鼠血清的雙向凝膠電泳及差異蛋白質(zhì)的鑒定. 比較AD大鼠與正常大鼠血清兩種樣本的雙向凝膠電泳圖譜，AD血清樣本中有10個差異蛋白質(zhì)點，均為蛋白表達下調(diào)。選取其中2個差異最為明顯的蛋白（蛋白濃度相差3倍以上）進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜分析得到數(shù)據(jù)在SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫中搜索查詢，發(fā)現(xiàn)并鑒定出這2個蛋白分別為：血漿視黃醇結(jié)合蛋白（RBP）前體，補體成分4，基因2（C4b）。 結(jié)論：

7、 1.AD大鼠海馬突觸體的3個差異蛋白質(zhì)和AD大鼠血清的2個差異蛋白質(zhì)是不同的蛋白質(zhì)。 2.AD大鼠海馬突觸體表達下調(diào)顯著的3個蛋白：α-2球蛋白鏈，PPIase A，cofilin-1，它們表達下調(diào)和AD記憶障礙關(guān)系的可能機制如下： （1）α-2球蛋白鏈表達下調(diào)，可能降低突觸的信號傳遞能力，導(dǎo)致記憶障礙。 （2）PPIase A參與神經(jīng)細胞的Caspase級聯(lián)反應(yīng)，其表達下調(diào)引起AD發(fā)病的可能機制是由于細胞凋亡

8、和信號傳導(dǎo)能力下降，導(dǎo)致突觸的信號傳遞功能下降，導(dǎo)致記憶障礙。 （3）Cofilin-1參與神經(jīng)管形態(tài)的形成和神經(jīng)嵴的遷移，并參與細胞凋亡。其表達下調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡，損壞軸突和樹突的功能，可能導(dǎo)致突觸的傳遞能力下降，造成AD的記憶障礙。 3.AD大鼠血清表達下調(diào)顯著的2個蛋白：RBP前體和C4b，它們表達下調(diào)和AD記憶障礙關(guān)系的可能機制如下： （1）C4b參與Aβ的清除，其表達下調(diào)，會使Aβ的清除受到影響，而