survivin反義寡核苷酸在耐藥肝細(xì)胞癌的治療作用研究.pdf

1、目的 采用反義技術(shù)封閉survivin基因在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，探討survivin反義寡核苷酸對人肝癌耐藥細(xì)胞株SMMC-7721/ADM的增殖及凋亡的影響；對人肝癌耐藥細(xì)胞株SMMC-7721/ADM化療敏感性的影響；觀察其對人耐藥肝癌細(xì)胞SMMC-7721裸鼠移植瘤的治療作用。 方法 本實(shí)驗(yàn)共分三部分進(jìn)行。 第一部份：Survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)肝癌耐藥細(xì)胞SMMC-7721/ADM凋亡的研究。

2、 分別以脂質(zhì)體介導(dǎo)200ng/ml、400ng/ml和600ng/ml3種不同濃度的反義 (1)空白對照組、空脂質(zhì)體組及正義寡核苷酸組三組之間相比，細(xì)胞生長率無明顯差異(p＞0.05)。 (2)survivin反義寡核苷酸作用的三組分別與空白對照組、空脂質(zhì)體組及正義寡核苷酸組相比，細(xì)胞生長率差異顯著，經(jīng)survivin反義寡核苷酸作用后的細(xì)胞生長受到明顯的抑制(p＜0.001)。 (3)經(jīng)不同濃度的surv

3、ivinASODN處理不同時(shí)間的細(xì)胞均受到抑制，隨著survivinASODN濃度的增加，抑制作用越來越明顯，呈濃度-效應(yīng)關(guān)系，其中600ng/mlsurvivinASODN轉(zhuǎn)染組72h時(shí)的細(xì)胞生長抑制率可達(dá)(66.08±7.76)％。 1.3.RT-PCR結(jié)果： (1)空白對照組、空脂質(zhì)體組、正義寡核苷酸組和survivinASODN處理組在191bp處均出現(xiàn)特異性的survivin條帶。 (2)200ng/m

4、lsurvivinASODN組、空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對照組、正義鏈轉(zhuǎn)染對照組之間survivinmRNA表達(dá)無明顯差異(p＞0.05)。 (3)400ng/ml、600ng/mlsurvivinASODN轉(zhuǎn)染后survivinmRNA較三組對照組顯著降低(p＜0.01)。 1.4.Westernblot檢測結(jié)果： (1)Survivin蛋白在人耐藥肝癌細(xì)胞SMMC-7721/ADM中有高度表達(dá)。 (2)

5、空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對照組、正義鏈轉(zhuǎn)染對照組之間比較survivin蛋白表達(dá)無明顯差異(p＞0.05)。 (3)200ng/ml、400ng/ml、600ng/mlsurvivinASODN轉(zhuǎn)染后survivin蛋白較三組對照組顯著降低。 1.5.流式細(xì)胞檢測： 經(jīng)200ng/ml、400ng/ml、600ng/mlsurvivinASODN處理72h后SMMC-7721/ADM細(xì)胞，與空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對

6、照組、正義鏈轉(zhuǎn)染對照組相比，反義核苷酸組在G1期前出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰，細(xì)胞凋亡率明顯高于三組對照組(p＜0.05)，SurvivinASODN轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞明顯減少，S期細(xì)胞無明顯變化，G2/M寡核苷酸轉(zhuǎn)染人肝癌耐藥細(xì)胞株SMMC-7721/ADM，無義寡核苷酸、脂質(zhì)體及RPMI1640培養(yǎng)液作為空白對照，采用MTT法檢測survivin反義寡核苷酸對SMMC-7721/ADM細(xì)胞的生長抑制作用；RT-PCR，westernbl

7、ot方法檢測各組細(xì)胞survivinmRNA及蛋白的表達(dá)情況；流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的變化；透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。 第二部份：Survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)肝癌耐藥細(xì)胞凋亡及與阿霉素聯(lián)合化療的關(guān)系研究 將培養(yǎng)的人肝癌耐藥細(xì)胞SMMC-7721/ADM分為：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對照組、單純阿霉素組、正義寡核苷酸轉(zhuǎn)染組、正義寡核苷酸轉(zhuǎn)染＋可霉素組、400ng/mlASODN組、400ng/mlASODN+阿霉素

8、組，共6組，分別進(jìn)行處理。用MTT法檢測細(xì)胞相對存活率；RT-PCR檢測survivinmRNA；Westernblot檢測SMMC-7721細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)。研究survivin反義寡核苷酸對SMMC-7721/ADM化療敏感性的影響。 第三部份：Survivin反義寡核苷酸抑制肝癌裸鼠皮下移植瘤生長的作用研究 建立人耐藥肝癌細(xì)胞SMMC-7721/ADM移植瘤模型，成瘤后隨機(jī)分6組：空白對照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

9、組、正義寡核苷酸轉(zhuǎn)染組、200ng/mlASODN轉(zhuǎn)染組、400ng/mlASODN轉(zhuǎn)染組、600ng/mlASODN組。分別使用相應(yīng)復(fù)合物進(jìn)行瘤體注射，每隔5天注射1次，共3次。觀察腫瘤體積和動(dòng)物的體重的變化，計(jì)算腫瘤抑制率；光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；采用免疫組化檢測腫瘤組織中survivin變化；westernblot、、RT-PCR檢測治療前后各組腫瘤組織中survivinmRNA和蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果 1.Su

10、rvivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)肝癌耐藥細(xì)胞SMMC-7721/ADM凋亡。 1.1.脂質(zhì)體介導(dǎo)5'端以FAM熒光素標(biāo)記的survivin反義寡核苷酸，可以高效率轉(zhuǎn)染人肝癌耐藥細(xì)胞SMMC-7721/ADM，各組轉(zhuǎn)染效率達(dá)60％以上。 1.2.MTT法檢測各組人耐藥肝癌SMMC-7721/ADM細(xì)胞生長抑制率：期細(xì)胞顯著增加，細(xì)胞被阻滯于G2/M期。 1.6.透射電鏡觀察人耐藥肝癌SMMC-7721/ADM細(xì)胞超微結(jié)

11、構(gòu)經(jīng)反義核酸作用后48h，在600ng/mlASODN/Lip組作用發(fā)現(xiàn)大量的凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞核邊聚，核濃縮，核碎裂等。 2.Survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)肝癌耐藥細(xì)胞凋亡及與阿霉素聯(lián)合化療的關(guān)系。 2.1.MTT法檢測人耐藥肝癌SMMC-7721/ADM細(xì)胞生長抑制率： (1)空脂質(zhì)體組、阿霉素組、正義寡核苷酸組、正義寡核苷酸+阿霉素組之間比較無顯著差異(p＞0.05)； (2)反義寡核苷酸組和反

12、義寡核苷酸+阿霉素組與上述4組比較，細(xì)胞生長受到明顯的抑制，具有顯著性差異(p＜0.05)； (3)單獨(dú)應(yīng)用survivin反義寡核苷酸治療組與應(yīng)用阿霉素聯(lián)合survivin反義寡核苷酸組比較，阿霉素聯(lián)合survivin反義寡核苷酸組細(xì)胞生長受到更明顯的抑制，具有顯著性差異(p＜0.05)。 2.2.耐藥肝癌SMMC-7721/ADM細(xì)胞survivinmRNA的表達(dá)情況 (1)凝膠成像顯示所有實(shí)驗(yàn)組在191bp

13、處均出現(xiàn)特異性的survivin條帶。 (2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對照組、阿霉素組、正義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對照組、正義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對照＋可霉素組之間survivinmRNA表達(dá)無明顯差異(p＞0.05)。 (3)400ng/mlsurvivinASODN組和400ng/mlASODN組＋可霉素組survivinmRNA表達(dá)較其他4組顯著降低(p＜0.05)，但其兩組之間無明顯差異(p＞0.05)。 2.3耐藥肝癌SMMC-772

14、1/ADM細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)的情況 (1)Survivin蛋白在人耐藥肝癌細(xì)胞SMMC-7721/ADM中有高度表達(dá)。 (2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對照組、阿霉素組、正義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對照組、正義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對照＋可霉素組之間survivin蛋白表達(dá)無明顯差異(p＞0.05)。 (3)400ng/mlsurvivinASODN組和400ng/mlASODN組+阿霉素組survivinmRNA較其他4組顯著降低(p＜0

15、.05)，但其兩組之間表達(dá)無明顯差異(p＞0.05)。 3.Survivin反義寡核苷酸抑制肝癌裸鼠皮下移植瘤生長的作用 3.1全部裸小鼠接種人肝癌耐藥細(xì)胞系SMMC-7721/ADM單細(xì)胞懸液后，均存活并有腫瘤形成，接種點(diǎn)無紅腫破潰表現(xiàn)，成瘤時(shí)間為(13.5±2.1)d。 3.2SurvivinASODN對人肝癌裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用： (1)注射后20d處死裸鼠測定脂質(zhì)體對照組，脂質(zhì)體ASODN對