雞柔嫩艾美球蟲重組SO7抗原的免疫保護(hù)作用.pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美屬(Eimeria)的多種球蟲寄生于雞消化道引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的原蟲病，全世界每年因雞球蟲病而造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)20億美元以上。我國是養(yǎng)雞大國，占世界總養(yǎng)雞量的10％，每年由雞球蟲病造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失難以估計(jì)。目前球蟲病主要依靠藥物防治，但由于球蟲耐藥性的不斷增強(qiáng)以及藥物殘留肉蛋危害人體健康，使得藥物防治雞球蟲病舉步維艱，也迫使人們將目光轉(zhuǎn)向免疫預(yù)防等替代控制方法。本研究對(duì)柔嫩艾

2、美球蟲揚(yáng)州株(Etenella，YZ株)子孢子表面抗原SO7基因進(jìn)行了克隆、序列分析和原核表達(dá)，比較了常規(guī)佐劑、細(xì)胞因子和中藥等3種不同類型佐劑對(duì)重組S07抗原免疫保護(hù)效果的影響，以及SO7抗原對(duì)巨型艾美球蟲(Emaxima)的交叉免疫保護(hù)作用，為在臨床上利用亞單位疫苗控制雞球蟲病奠定基礎(chǔ)。 一、E. tene//a YZ株SO7基因的克隆和序列分析以Etenella YZ株卵囊孢子化培養(yǎng)7 h時(shí)提取的總RNA為模板，設(shè)計(jì)特異性

3、引物，應(yīng)用兩步法RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出。SO7基因的特異性片段。將擴(kuò)增片段插入pUCm-T載體，隨機(jī)選擇經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR及酶切鑒定為陽性的2個(gè)克隆分別進(jìn)行測(cè)序分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，2個(gè)陽性克隆所含插入片段的DNA序列完全一致，含一全長651個(gè)核苷酸的開放閱讀框，富含AGC和CTG重復(fù)序列，編碼區(qū)核苷酸與LS18株和BJ株的同源性均為99.5％，與HB株同源性為99.4％，與GD株同源性為99.7％。推測(cè)其氨基酸序列與LS

4、18株和GD株的同源性都為99.1％，與BJ和HB株同源性為98.6％。通過對(duì)其蛋白抗原性、表面可能性、親水性、柔性區(qū)和二級(jí)結(jié)構(gòu)等參數(shù)預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)YZ株核苷酸的變異未引起其蛋白主要特性和抗原表位的變化。 二、SO7基因在大腸桿菌中的融合表達(dá)根據(jù)Etenella YZ株SO7抗原基因的cDNA序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，經(jīng)PCR從陽性質(zhì)粒模板中擴(kuò)增出SO7基因不含信號(hào)肽的編碼區(qū)片段。將該基因片段酶切回收后按正確的閱讀框架克隆入大腸桿菌表達(dá)

5、載體pGEX-6P-1谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的下游，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pG：EX-6P-1-SO7，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。重組菌經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后，通過SDS．PAGE電泳和Westem-blot證實(shí)，SO7基因在大腸桿菌中得到了融合表達(dá)，融合蛋白分子量約為48 Ku?？扇苄苑治霰砻?，融合蛋白主要以包涵體形式存在。通過融合蛋白切膠免疫小鼠制備高免血清，經(jīng)過間接ELISA檢測(cè)其與Etenella子孢子抗原反應(yīng)的特異性，結(jié)果證實(shí)融合蛋白具有一定的免

6、疫原性。三、重組大腸桿菌表達(dá)條件的優(yōu)化對(duì)表達(dá)Etenella SO7抗原重組基因工程大腸桿菌pGEX-6P-1-SO7/BL21的搖瓶表達(dá)條件如誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度進(jìn)行了優(yōu)化研究。在所試條件中，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)間是影響表達(dá)的主要因素，誘導(dǎo)溫度與IPTG濃度次之。誘導(dǎo)前培養(yǎng)時(shí)間以3 h為最佳，誘導(dǎo)時(shí)間以4.5 h為最佳。在34～40℃范圍內(nèi)，誘導(dǎo)溫度對(duì)表達(dá)量的影響不大，以37℃最佳。IPTG濃度在0.008～1 mm

7、ol/L范圍內(nèi)，對(duì)表達(dá)量的影響不大。在優(yōu)化的表達(dá)條件下，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，表達(dá)量達(dá)到菌體總蛋白的37.5％，為大量獲得重組蛋白奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 四、重組SO7抗原對(duì)E tene//a的免疫保護(hù)效果對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步純化和復(fù)性，制備免疫原。分別使用不同劑量的人參總皂甙和重組γ-干擾素以及弗氏完全佐劑作為免疫佐劑，于5日齡、12日齡和19日齡對(duì)雛雞進(jìn)行3次免疫，同時(shí)設(shè)立蛋白口服免疫組、蛋白皮下注射免疫組、卵囊口服免疫組

8、、未免疫未攻毒組和未免疫攻毒組作對(duì)照，于26日齡用10<'5>個(gè)Etenella孢子化卵囊進(jìn)行攻毒，8 d后撲殺，對(duì)各組的存活率、相對(duì)增重率、病變減少率、相對(duì)卵囊產(chǎn)量和抗球蟲指數(shù)(ACI)等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明，與非免疫攻毒組及不加佐劑的免疫攻毒組相比，佐劑使用后各組的增重、病變記分、相對(duì)卵囊產(chǎn)量、ACI等指標(biāo)均有一定的改善，對(duì)Etenella的攻擊可以提供部分保護(hù)。3種佐劑中，γ-干擾素和人參總皂甙能增強(qiáng)重組抗

9、原的免疫保護(hù)效果，且佐劑的劑量對(duì)免疫保護(hù)的效果有一定的影響，以5 000 U γ-干擾素效果最佳，效果與Etenella活卵囊免疫相當(dāng)，弗氏完全佐劑的免疫增強(qiáng)效果不明顯。單獨(dú)使用重組蛋白皮下注射或口服免疫，雖有一定的保護(hù)作用，但不明顯。一定劑量的γ-干擾素對(duì)重組抗原的免疫保護(hù)效果起明顯的增強(qiáng)作用，是一個(gè)具有很好的臨床應(yīng)用前景的新型佐劑。 五、重組SO7抗原對(duì)E.maxima的交叉免疫保護(hù)效果采用5000 U重組γ-干擾素作為重組

10、蛋白的免疫佐劑，于5日齡、12日齡和19日齡對(duì)雛雞進(jìn)行3次免疫，同時(shí)設(shè)立蛋白皮下注射免疫組、E.tenella卵囊口服免疫組和Emaxima卵囊口服免疫組、未免疫未攻毒組和未免疫攻毒組作對(duì)照，于26日齡用5×10<'4>個(gè)E.maxima卵囊進(jìn)行攻毒，8 d后撲殺，以平均增重、相對(duì)增重率、卵囊產(chǎn)量、相對(duì)卵囊產(chǎn)量等指標(biāo)評(píng)價(jià)其交叉免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，E.maxima卵囊口服免疫對(duì)E.maxima保護(hù)效果最佳，單獨(dú)使用重組蛋白皮下注射對(duì)增