重組血管生長(zhǎng)抑制因子Kringle 5的分離純化.pdf

1、血管生長(zhǎng)抑制因子 kringle 5 是目前發(fā)現(xiàn)的抑制血管增生活性最強(qiáng)的溶酶原片段，可有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。它具有高效、高細(xì)胞選擇性以及短的氨基酸序列的特點(diǎn)，這使它具有治療血管增生性疾病的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。 本研究在構(gòu)建融合型血管生長(zhǎng)抑制因子kringle 5原核表達(dá)系統(tǒng)及工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究基礎(chǔ)上，開始rK5蛋白分離純化工藝的探索研究。先后采用了中性鹽沉淀法(包括氯化鈉和硫酸銨的分級(jí)沉淀)、等電點(diǎn)沉淀法、柱色譜法等

2、多種不同的分離純化工藝，反復(fù)試驗(yàn)、逐步篩選，最后建立了兩步柱色譜法分離純化重組kringle 5的新工藝。 兩步柱色譜法分離純化重組血管生長(zhǎng)抑制因子kringle 5的工藝主要包括：Ni<'2+>螯合的 Chelating Sepharose Fast Flow 親合柱色譜和Sephadex G-75凝膠排阻柱色譜。其中Ni<'2+>螯合的 Chelating Sepharose Fast Flow親和色譜柱規(guī)格為20×1.0

3、cm i．d．，流動(dòng)相 A 為20 mmol/L PBS+0.5 mol/L NaCl (pH 7.4)溶液，流動(dòng)相B為20 mmol/L PBS+0.5 mol/L NaCl+0.5 mol/L 咪唑 (pH 7.4)溶液，采用等度+梯度的方式洗脫，洗脫流速為2.0 mL/min。Sepharose G-75凝膠排阻色譜柱規(guī)格為100×1.5 cm i．d．，流動(dòng)相為10 mmol/L PBS+0.15 mol/L NaCl (pH

4、7.4)溶液，采用等度方式洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min。研究發(fā)現(xiàn)采用此工藝后，經(jīng)第一步親和柱色譜分離得到的目的蛋白用變性聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)分析，其純度約為80％，蛋白得率約為1.92％；再經(jīng)第二步凝膠柱色譜分離后得到目的蛋白純度約為96％，蛋白總得率約為0.63％。最后，采用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)法對(duì)得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行生物活性分析，結(jié)果表明純化產(chǎn)物對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生長(zhǎng)抑制作用明顯。 研究結(jié)果表明，兩