蚜蟲(chóng)與其內(nèi)共生菌Buchnera之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究.pdf

1、幾乎所有的蚜蟲(chóng)體內(nèi)都含有一種內(nèi)共生菌Buchnera，這種共生菌在分類上屬于和Escherichia coli非常相近的γ-proteobacterium。該共生茵存在于蚜蟲(chóng)腹部的專為內(nèi)共生茵而特化的細(xì)胞含菌細(xì)胞(mycetocytes或bacteriocytes)的胞質(zhì)中，該共生茵隨親代垂直傳遞給后代。蚜蟲(chóng)與Buchnera互利共生；Buchnera充分供給蚜蟲(chóng)不能從外界獲得的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而滿足蚜蟲(chóng)生存和繁殖的需要；同樣，Buch

2、nera離開(kāi)蚜蟲(chóng)也不能存活。國(guó)外學(xué)者通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)一些蚜蟲(chóng)體內(nèi)的Buchnera進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)共生菌全序列基因組大大縮小，但保留了多數(shù)必需氨基酸合成的基因。 正是由于Buchnera對(duì)蚜蟲(chóng)的重要作用，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)Buchnera開(kāi)展了相關(guān)研究。國(guó)外學(xué)者對(duì)Buchnera的研究，涉及了Uroleucon sp．，Acryrthosiphon pisum，Diuraphis noxia(Kurdj)，Schizaphis

3、 graminum等有限的蚜蟲(chóng)，這些研究通過(guò)分析這些蚜蟲(chóng)Buchnera及其這些蚜蟲(chóng)自身的系統(tǒng)進(jìn)化，探討了這些蚜蟲(chóng)Buchnera與其寄主之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。但是這些研究未曾涉及桃蚜、豆蚜、棉蚜。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)這三種蚜蟲(chóng)Buchnera的研究很少，僅僅涉及了桃蚜的Buchnera groEL基因和16srDNA基因。這三種蚜蟲(chóng)遍及中國(guó)乃至世界各地，屬于多食性害蟲(chóng)，危害白菜、黃瓜、西紅柿、茄子、豆科植物等多種蔬菜和農(nóng)作物。鑒于Buchnera

4、與蚜蟲(chóng)的特殊關(guān)系，對(duì)這些蚜蟲(chóng)體內(nèi)的Buchnera開(kāi)展研究非常必要。本研究首先分別探討了這三種蚜蟲(chóng)及其內(nèi)共生菌Buchnera的系統(tǒng)進(jìn)化特征，然后綜合分析了這三種蚜蟲(chóng)與其內(nèi)共生菌Buchnera的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。 一、試驗(yàn)材料的采集和飼養(yǎng) 選擇典型的危害嚴(yán)重的三種蔬菜蚜蟲(chóng)：桃蚜、豆蚜、棉蚜為研究對(duì)象。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分別用蘿卜、菜豆、黃瓜進(jìn)行飼養(yǎng)；各種群分別置于50×50×50的正方體鐵架外罩100目雙層沙網(wǎng)內(nèi)，飼養(yǎng)條件為20±

5、2℃，相對(duì)濕度60-70％。 二、測(cè)定三種蚜蟲(chóng)的mtDNA COⅠ/COⅡ、12S/16SrRNA以及核基因EFlalpha的序列，分析三種蚜蟲(chóng)的系統(tǒng)進(jìn)化 在這部分工作中，通過(guò)以前的研究中采用的引物擴(kuò)增了并測(cè)定了桃蚜、豆蚜、棉蚜的線粒體基因COⅠ/COⅡ、 12S/16S rRNA以及核基因EFalpha的序列。每個(gè)地理種群隨機(jī)抽取3～5個(gè)樣本進(jìn)行序列測(cè)定，以它們的一致序列為準(zhǔn)。利用“BLAST”工具(NCBI站點(diǎn))對(duì)測(cè)

6、定的序列進(jìn)行分析、DNA序列檢索；用GenDoc軟件進(jìn)行序列同源性比較；用BioEdit軟件進(jìn)行序列編輯；用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(duì)；比對(duì)結(jié)果輸入MEGA2.0軟件，采用距離法計(jì)算各樣品問(wèn)的遺傳距離，并基于Kimura-2-Parameter模型，用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)自展1000次檢驗(yàn)獲得系統(tǒng)樹(shù)分支的置信度。 比較測(cè)定的這些基因序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四個(gè)地理種群的桃蚜的COⅠ/COⅡ、12S/16SrRNA和

7、EFlalpha基因序列差異非常小，相似性高達(dá)99％。而桃蚜和棉蚜的COⅠ/COⅡ、EFlalpha的這些基因序列相似性為90％左右；桃蚜和豆蚜的COⅠ/COⅡ、EFlalpha基因序列的相似性分別為近85％、近90％，豆蚜和棉蚜的COⅠ/COⅡ、EFlalpha的相似性分別為過(guò)85％、近93％。但是，兩種蚜蟲(chóng)的12S/16SrRNA基因序列的相似性則基本達(dá)95％。 分析這些序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以發(fā)現(xiàn)，桃蚜與麥雙尾蚜的親緣關(guān)系

8、最近。豆蚜和棉蚜的親緣關(guān)系最近，它們又與麥二叉蚜關(guān)系最近。 三、測(cè)定并分析Buchnera的trpB、dnaN、trpEG的序列，分析三種蚜蟲(chóng)Buchnera的系統(tǒng)進(jìn)化 首先，通過(guò)Buchnera的基因探討了這三種蚜蟲(chóng)體內(nèi)共生茵B(yǎng)uchnera的系統(tǒng)進(jìn)化。具體來(lái)說(shuō)，根據(jù)GenBank登錄的Uroleucon sp．、Acryrthosiphon pisum、Rhopalosiphum padi以及Schizaphis g

9、raminum等已知蚜蟲(chóng)的Buchnera trpB、dnaN、trpEG 的基因片段序列，利用 Primer Premier 5.0 (http ： //www．premierbiosoft．com/primerdesign)軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增了并測(cè)定了桃蚜、豆蚜、棉蚜內(nèi)共生菌Buchnera的trpB、dnaN、trpEG的基因片段序列。每個(gè)地理種群隨機(jī)抽取3～5個(gè)樣本進(jìn)行序列測(cè)定，以它們的一致序列為準(zhǔn)。利用“BLAST”工具(NC

10、BI站點(diǎn))對(duì)測(cè)定的序列進(jìn)行分析、DNA序列檢索；用GenDoc軟件進(jìn)行序列同源性比較；用BioEdit軟件進(jìn)行序列編輯；用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對(duì)；比對(duì)結(jié)果輸入MEGA2.0軟件，采用距離法計(jì)算各樣品間的遺傳距離，并基于Kimura-2Parameter模型，用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)自展1000次檢驗(yàn)獲得系統(tǒng)樹(shù)分支的置信度。 比較獲得的這些基因序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四個(gè)地理種群的桃蚜的trpB、dnaN、trpE

11、G基因序列差異很??；而桃蚜與豆蚜、桃蚜與棉蚜之間的trpB、dnaN、trpEG基因序列差異非常明顯，豆蚜與棉蚜的這三段序列差異相對(duì)小一些。由trpB、dnaN、trpEG的基因片段序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)可以發(fā)現(xiàn)，四個(gè)地理種群桃蚜的trpB、dnaN基因序列均處于同一支序，它們又與麥雙尾蚜的相應(yīng)基因序列形成一個(gè)分支，即桃蚜和麥雙尾蚜的Buchnera的親緣關(guān)系最近；并且桃蚜Buchnera的兩個(gè)染色體基因trpB、dnaN的系統(tǒng)進(jìn)化與其質(zhì)粒基

12、因trpEG的進(jìn)化關(guān)系一致，即桃蚜的質(zhì)粒基因trpEG可能隨其Buchnera垂直傳遞。 而豆蚜和棉蚜的trpB、dnaN基因序列總是處于一個(gè)支序，關(guān)系最近，但是豆蚜和棉蚜所在的這一亞支序的在系統(tǒng)樹(shù)中的所處的分支變化不定，因此，只能認(rèn)為豆蚜和棉蚜的Buchnera的親緣關(guān)系最近，至于兩者又與已知的其它何種蚜蟲(chóng)的Buchnera的親緣關(guān)系最近不能確定。豆蚜和棉蚜的trpEG基因序列處于緊緊相鄰的分支，并且這兩個(gè)相鄰的分支所處的大分

13、支與trpB、dnaN基因序列所處的分支也不一樣，所以它們的Buchnera trpEG基因是否隨．Buchnera垂直傳遞，則不能十分確定。 四、蚜蟲(chóng)與其內(nèi)共生茵B(yǎng)uchnera之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 分析蚜蟲(chóng)與其內(nèi)共生菌Buchnera之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究很少，本研究通過(guò)比較桃蚜、豆蚜、棉蚜及其內(nèi)共生菌Buchnera的系統(tǒng)進(jìn)化特征，揭示了這三種蚜蟲(chóng)與其內(nèi)共生菌Buchnera的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)，桃蚜與其Buch

14、nera的進(jìn)化關(guān)系一致均與麥雙尾蚜的親緣關(guān)系最近，即桃蚜與其Buchnera是協(xié)同進(jìn)化的。豆蚜、棉蚜與其內(nèi)共生菌Buchnera可能不是嚴(yán)格協(xié)同進(jìn)化的。所以認(rèn)為不同蚜蟲(chóng)與其內(nèi)共生菌Buchnera的進(jìn)化關(guān)系可能不同，這一結(jié)論與前人的研究也是吻合的。這一工作不僅彌補(bǔ)了這三種蚜蟲(chóng)與其內(nèi)共生菌Buchnera之間的進(jìn)化關(guān)系空白，同時(shí)有助于在了解這些蚜蟲(chóng)Buchnera的系統(tǒng)進(jìn)化特征的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步全面地了解了這三種蚜蟲(chóng)的內(nèi)共生菌Buchner