髓樣細(xì)胞分化蛋白88抑制乙型肝炎病毒復(fù)制的機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B vires,HBV)屬于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviradae),具有獨(dú)特的基因組結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性。由HBV感染引起的乙型肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。目前,臨床上針對(duì)HBV感染的抗病毒藥物主要為核苷類似物和干擾素-α(Interferon-α,IFN-α)。IFN-α的抗HBV的機(jī)制以及相關(guān)的干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的生物學(xué)功能尚未完全闡明。我們

2、和其他實(shí)驗(yàn)室以前的研究結(jié)果顯示,髓樣細(xì)胞分化蛋白88(Myeloiddifferentiation primary response protein88,MyD88)的表達(dá)能被干擾素誘導(dǎo),并且在肝腫瘤細(xì)胞中能通過(guò)激活NF-κB抑制HBV的復(fù)制。與此同時(shí),HBV編碼的聚合酶蛋白通過(guò)抑制statl的入核下調(diào)MyD88啟動(dòng)子活性從而抑制干擾素誘導(dǎo)的MyD88的表達(dá)。這些結(jié)果提示,MyD88可能在干擾素抑制ItBV復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是MyD

3、88的抗病毒機(jī)制仍不甚明了,有必要進(jìn)一步研究其詳細(xì)的作用機(jī)制。
　　為了進(jìn)一步驗(yàn)證MyD88的抗病毒作用,首先用MyD88重組腺病毒(Ad-MyD88)感染有穩(wěn)定HBV復(fù)制的HepG2.2.15細(xì)胞,然后用Northern-blot和Southem-blot檢測(cè)病毒:RNA和病毒核心顆粒相關(guān)DNA水平。結(jié)果顯示,與對(duì)照相比,Ad-MyD88感染同等程度地降低了病毒RNA和核心顆粒相關(guān)DNA的水平,提示MyD88抗病毒作用的一級(jí)靶位

4、點(diǎn)可能是病毒RNA,這一點(diǎn)隨后用只能進(jìn)行病毒RNA的轉(zhuǎn)錄而不能進(jìn)行病毒基因組復(fù)制的pCIdA-HBV所證實(shí)。此外在通過(guò)小鼠尾靜脈高壓注射HBV復(fù)制質(zhì)粒建立的急性感染模型中,MyD88也具有與在體外相似的抗病毒作用。
　　為了探討是否MyD88在生理?xiàng)l件下也能發(fā)揮抗病毒作用,將MyD88 siRNA轉(zhuǎn)入Huh7細(xì)胞,然后測(cè)定IFN-α的抗病毒活性。結(jié)果顯示,在MyD88 knock-down細(xì)胞中,HBV對(duì)IFN-α的抗病毒作用有了

5、一定的抵抗能力,提示MyD88在IFN-α抑制HBV復(fù)制中發(fā)揮一定作用。
　　MyD88能直接下調(diào)病毒RNA水平,這可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,也可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。結(jié)果顯示,MyD88對(duì)由HBV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子調(diào)控的熒光素酶的活性沒(méi)有顯著影響,但是能抑制受CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的pregenomic RNA的水平。這些結(jié)果提示,MyD88下調(diào)病毒RNA水平是一轉(zhuǎn)錄后水平事件。
　　為了進(jìn)一步研究MyD88轉(zhuǎn)錄后下調(diào)pregenomic

6、RNA的機(jī)制,利用Tet-off系統(tǒng)研究MyDS8對(duì)pregenomic RNA穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示MyD88可以降低pregenomic RNA的穩(wěn)定性。進(jìn)一步通過(guò)核漿分離顯示,MyD88降低了pregenomicRNA在胞漿中的穩(wěn)定性,但是對(duì)胞核中pregenomic RNA的穩(wěn)定性沒(méi)有影響。RNA干擾實(shí)驗(yàn)表明,MyD88對(duì)pregenomic RNA在胞漿中的降解是通過(guò)細(xì)胞中的兩條mRNA降解通路即5'-3' mRNA降解通路和

7、3'-5'mRNA降解通路進(jìn)行。
　　細(xì)胞蛋白La可與HBVpregenomic RNA特異結(jié)合促進(jìn)pregenomic RNA的穩(wěn)定性。但是本研究顯示,MyD88誘導(dǎo)pregenomic RNA的降解不依賴于La蛋白與pregenomic RNA的相互作用。進(jìn)一步通過(guò)mapping分析發(fā)現(xiàn)HBV(1804-2454)和HBV(1151-1684)是MyD88的應(yīng)答序列。隨后以pregenomie RNA為背景,構(gòu)建HBV(180

8、4-2454)和HBV(1151-1684)的缺失突變體,然后測(cè)定它們對(duì)MyD88的敏感性。結(jié)果顯示,HBV(1151-1684)的缺失突變體仍然保留著對(duì)MyD88的應(yīng)答能力,而HBV(1804-2454)的缺失突變體喪失了對(duì)MyD88的敏感性,表明位于HBV pregenomic RNA5'末端的HBV(1804-2454)序列為MyD88誘導(dǎo)pegenomic RNA降解的一個(gè)關(guān)鍵的順式作用序列。
　　RNA序列HBV(115

9、1-1684)位于HBV pregenomic RNA和preS/S RNAs的重疊區(qū)域,因此它可能選擇性賦予了preS/S RNAs對(duì)MyD88的敏感性。結(jié)果顯示,RNA序列HBV(1151-1684)選擇性介導(dǎo)了HBV preS/S RNA的降解,并且這種降解主要發(fā)生在核內(nèi)。
　　有趣的是RNA序列HBV(1151-1684)與HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(posttranscriptional regulatory,element,

10、PRE)完全重疊。HBV PRE選擇性介導(dǎo)preS2/S RNAs出核,不能出核的RNA最后以一種未知的機(jī)制在核中降解。因此MyD88導(dǎo)致preS/S RNAs在核中降解可能是由于MyD88干擾了PRE介導(dǎo)的preS/S RNAs出核所導(dǎo)致。通過(guò)CAT活性分析顯示,MyD88可以降低PRE介導(dǎo)的CAT活性,并且不是由于MyD88直接導(dǎo)致其在核中降解所造成,因?yàn)樵赑RE出核抑制蛋白NES(-)RanBP1共表達(dá)的條件下,MyD88不能進(jìn)一

11、步抑制CAT的活性,而PRE的核輸出因子多嘧啶莖結(jié)合蛋白(polypyrimidne tract-bindingprotein,PTB)的表達(dá)幾乎完全恢復(fù)了PRE促進(jìn)出核的功能。隨后通過(guò)核漿分離用Northem-blot證實(shí)了CAT活性分析的結(jié)果。因此,從以上結(jié)果可以得出MyD88抑制了PRE介導(dǎo)的preS2/S RNAs出核。
　　為了進(jìn)一步研究MyD88抑制PRE介導(dǎo)的preS/S RNAs出核機(jī)制,檢測(cè)了PTB的表達(dá)水平。結(jié)