甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育基因BnMS5的克隆和功能分析.pdf

1、甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育系Rs1046A和FM195A是從Yi3A轉(zhuǎn)育而來(lái)的顯性核不育系。前人的遺傳分析研究顯示，該不育系統(tǒng)的育性受到同一位點(diǎn)的三個(gè)復(fù)等位基因控制，這3個(gè)復(fù)等位基因分別為BnMS5a（恢復(fù)基因），BnMS5b（不育基因）和BnMS5c（正常可育或臨保系基因），且3個(gè)等位基因之間的顯隱性關(guān)系為BnMS5a＞ BnMS5b＞ BnMS5c。為了闡明顯性核不育的機(jī)制，我們通過(guò)圖位克隆的方法獲得了育性調(diào)控基因BnMS5。之后，對(duì)

2、BnMS5的表達(dá)模式、起源進(jìn)化和不同等位基因的功能分化進(jìn)行了詳細(xì)的分析。結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法研究顯示，BnMS5a可能通過(guò)調(diào)節(jié)減數(shù)分裂染色體的濃縮使染色體維持正常的結(jié)構(gòu)，從而保證減數(shù)分裂的順利完成。主要研究結(jié)果如下:
　　1.恢復(fù)基因BnMS5a的克隆
　　通過(guò)篩選一個(gè)包含目的等位基因BnMS5a和BnMS5b的BAC文庫(kù)，獲得了BnMS5位點(diǎn)的物理圖譜。結(jié)合之前研究獲得的包含BnMS5c區(qū)段的序列，根據(jù)甘藍(lán)型油菜

3、參考基因組信息，對(duì)標(biāo)記BE10和SCD8間的序列進(jìn)行注釋，比對(duì)不同等位基因的序列信息，選擇其中一個(gè)在三個(gè)復(fù)等位基因中序列均有差異的基因作為候選基因。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)確定來(lái)自于恢復(fù)系中的BnaA08g25920D可以恢復(fù)不育系的育性，即為目的等位基因BnMS5a。
　　2.BnMS5等位基因的序列分析
　　三個(gè)復(fù)等位基因的序列比對(duì)分析顯示，BnMS5a和BnMSc在編碼區(qū)序列差異較小，僅有18個(gè)氨基酸的差異，但啟動(dòng)子區(qū)序列一致

4、性僅為56.1％，差異極大。BnMS5b則為BnMS5a在第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)內(nèi)MULE類轉(zhuǎn)座子插入造成的功能缺失突變。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，BnMS5編碼一個(gè)功能未知的十字花科蕓薹屬特異蛋白，其N端有一個(gè)預(yù)測(cè)的Coiled-coil結(jié)構(gòu)域，C端為一個(gè)DUF626結(jié)構(gòu)域。
　　3.顯性核不育材料FM195A的染色體形態(tài)觀察
　　染色體展片結(jié)果觀察FM195A減數(shù)分裂各時(shí)期染色體的形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，細(xì)線期后染色體的形態(tài)開(kāi)始異常，染色體不能正

5、常凝集而是相互靠近形成緊實(shí)的一團(tuán)，減數(shù)分裂過(guò)程在細(xì)線期到偶線期的轉(zhuǎn)換過(guò)程中停滯。
　　4.BnMS5在減數(shù)分裂過(guò)程中的功能研究
　　45S、5SrDNA和pAtT4探針熒光原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)M195A中同源染色體在減數(shù)分裂偶線期不能正常配對(duì)，沒(méi)有觀察到端粒的花束狀結(jié)構(gòu)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)M195A中γH2AX信號(hào)與FM195B基本相同，表明DSB可正常形成;減數(shù)分裂染色體軸向元件關(guān)聯(lián)蛋白ASY1可正常定位到FM195

6、A染色體上，說(shuō)明減數(shù)分裂前期Ⅰ早期染色體蛋白軸的組裝過(guò)程基本正常。而黏著蛋白（cohesin蛋白）SYN1及聯(lián)會(huì)復(fù)合體中央元件重要組分ZYP1的定位受到嚴(yán)重影響，表明MS5是減數(shù)分裂特異的聯(lián)會(huì)復(fù)合體組裝所必需的;同時(shí)，HEI10信號(hào)也沒(méi)有定位到突變體染色體上，表明MS5也是減數(shù)分裂同源重組所需的。
　　5.BnMS5的表達(dá)分析
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，BnMS5a和BnMS5c在油菜花蕾，莖和葉中均有表達(dá)。利用RNA原位

7、雜交和GUS染色技術(shù)，我們檢測(cè)了BnMS5a在油菜花藥發(fā)育各個(gè)時(shí)期以及擬南芥各個(gè)組織中的表達(dá)狀況。RNA原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，BnMS5a在花粉母細(xì)胞時(shí)期花藥壁以及小孢子母細(xì)胞中可檢測(cè)到信號(hào)。GUS染色結(jié)果表明，BnMS5a在擬南芥各個(gè)組織中均有表達(dá)，其在花藥中的表達(dá)模式與原位雜交的結(jié)果基本一致。BnMS5b由于在第二個(gè)內(nèi)含子區(qū)轉(zhuǎn)座子的插入，使得基因的表達(dá)量顯著下降，RNA剪切異常，可以確定，BnMS5b是一個(gè)功能缺失基因型。轉(zhuǎn)錄和蛋白

8、表達(dá)分析顯示，MS5a的表達(dá)量最高，MS5c次之，MS5b最低。
　　6.BnMS5基因的起源和進(jìn)化分析
　　分離白菜、甘藍(lán)和甘藍(lán)型油菜中的同源基因發(fā)現(xiàn)，在油菜中除BnMS5外，還有兩個(gè)同源基因:BnMS5-COPY2和BnMS5-COPY3。進(jìn)化樹(shù)和序列一致性分析表明BnMS5的兩個(gè)有功能的等位基因BnMS5a和BnMS5c來(lái)源于白菜，而兩個(gè)同源基因則來(lái)源于甘藍(lán)。該基因只在蕓薹屬特異存在，是一個(gè)進(jìn)化上新近產(chǎn)生的蕓薹屬特異的