FNDC5對阿爾巴斯白絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成脂分化的影響.pdf

1、FNDC5(Ⅲ型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域包含蛋白5)是一種單次跨膜蛋白，其翻譯后加工產(chǎn)物鳶尾素(irisin)是一種肌肉分泌因子。Irisin在脂肪和能量代謝中發(fā)揮重要的作用，可以促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞棕色化并增加細(xì)胞能量代謝，F(xiàn)NDC5還參與了神經(jīng)元的發(fā)育，但對于該基因在脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響方面缺乏了解。本研究通過構(gòu)建FNDC5的過表達(dá)及干擾載體，對其在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成脂分化的過程進(jìn)行研究，探究其對成脂作用的影響。
　　(1) FN

2、DC5過表達(dá)以及干擾載體的構(gòu)建
　　本實(shí)驗(yàn)從肌肉細(xì)胞中克隆了FNDC5基因，將克隆得到的FNDC5片段與pIRES2-EGFP骨架載體連接，構(gòu)建了pIRES2-EGFP-FNDC5表達(dá)載體。對該載體經(jīng)酶切、測序及熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，并將載體轉(zhuǎn)入脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞檢測表達(dá)效率，發(fā)現(xiàn)該表達(dá)載體可使FNDC5的表達(dá)提高27.5倍。同時(shí)，我們根據(jù)FNDC5及其他轉(zhuǎn)錄本的同源區(qū)設(shè)計(jì)2條siRNA序列，與pSIREN-RetroQ-ZsGr

3、een骨架載體連接，得到FNDC5干擾載體。經(jīng)驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)入脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測后發(fā)現(xiàn)FNDC5的表達(dá)最多可降低34％。結(jié)果表明成功構(gòu)建FNDC5基因的過表達(dá)載體pIRES2-EGFP-FNDC5和干擾載體CTC0398-1-6。
　　(2) FNDC5對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響
　　通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將FNDC5過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h通過Western blotting檢測ERK

4、、p38和AKT蛋白及其磷酸化水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn): Fndc5基因的過表達(dá)可使脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞ERK、p38的磷酸化水平升高，對AKT的磷酸化水平?jīng)]有影響。結(jié)果表明FNDC5基因通過MAPK信號通路中的ERK1/2和p38蛋白的磷酸化水平影響細(xì)胞的生理活動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。
　　(3) FNDC5對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響
　　通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法分別將FNDC5過表達(dá)及干擾載體轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，隨后誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行成

5、脂分化。分別于誘導(dǎo)后24h、48h、72h、96h、120h檢測成脂分化過程中關(guān)鍵基因PPARγ、SREBP1、ACC、FABP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平，同時(shí)檢測白色脂肪表記基因ASC1及棕色脂肪標(biāo)記基因UCP1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明FNDC5基因?qū)PARγ、SREBP1、ACC、FABP4的mRNA表達(dá)起到促進(jìn)作用，對ASC1蛋白的表達(dá)有抑制作用，但是對PPARγ、SREBP1和ACC的蛋白表達(dá)沒有顯著性影響。通過油紅O對脂肪間