豆豉溶栓酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、豆豉是我國傳統(tǒng)的藥食兩用資源，溶栓酶是其中重要的生理活性物質(zhì)。本研究首先對14種豆豉產(chǎn)品的溶栓活性進行比較，然后對細菌型豆豉的代表產(chǎn)品——山東臨沂豆豉(半成品)進行深入研究。探索了豆豉溶栓酶的分離純化條件；確定了纖維蛋白平板法與水解酪蛋白法測定溶栓酶酶活的相關(guān)性；最后通過動物試驗證實了溶栓酶在體內(nèi)、外的溶栓作用。主要試驗結(jié)果如下： 1.利用纖維蛋白平板法對14種傳統(tǒng)豆豉產(chǎn)品的溶栓活性物質(zhì)進行研究。結(jié)果表明，豆豉提取物的溶栓活性范

2、圍為0.326～161.972尿激酶單位/mL。永川毛霉型豆豉提取物表現(xiàn)出的活性最大，達161.972尿激酶單位/mL，曲霉豆豉與辣豆豉活性較小。 2.豆豉溶栓酶的分離純化試驗首先確定了硫酸銨沉淀豆豉溶栓酶飽和度為75％，其純化倍數(shù)為6.56倍，回收率61.69％；不同離子交換劑對溶栓酶的吸附效果不同，在所選的兩種離子交換劑中，DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析更適合于溶栓酶的分離純化，得到純化倍數(shù)為9.87倍的豆豉

3、溶栓酶酶液，回收率為35.6％；最后經(jīng)過SephadexG-75凝膠過濾，得到較純的豆豉溶栓酶，最終純化倍數(shù)為11.29倍，回收率為6.55％。SDS-PAGE凝膠電泳顯示，經(jīng)純化后的酶無雜蛋白，初步鑒定其分子量接近31KD。 3.豆豉溶栓酶酶學(xué)性質(zhì)建立了一種更為簡便直觀的測定方法——水解酪蛋白法，并用該法測定豆豉溶栓酶的酶學(xué)性質(zhì)，該酶最適作用溫度為60℃，pH7～8時酶活性最高。豆豉溶栓酶在pH6～10的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較強，在2

4、5℃和37℃下，酶在4h內(nèi)基本沒有活性損失。高于45℃時酶活下降很快，60℃、0.5h酶活基本喪失。由試驗結(jié)果看出，該酶沒有明顯的金屬離子激活劑，高濃度的Cu2+、Fe3+、Al3+對酶有抑制作用；添加蛋白胨、明膠可以提高酶的活性。抑制劑PMSF對豆豉溶栓酶抑制率幾乎達到100％，EDTA、β-巰基乙醇對酶活幾乎無抑制作用。 4.動物試驗豆豉溶栓酶對血塊的體外溶解試驗結(jié)果表明：豆豉溶栓酶高、低劑量組對血塊的溶解率均明顯高于對照組

5、(P均為0.000)，并且隨劑量的增加和作用時間的延長，豆豉溶栓酶對血塊的溶解作用更為顯著。 豆豉溶栓酶對小鼠尾靜脈血栓形成的預(yù)防試驗表明：豆豉溶栓酶大、小劑量組(分別為1000、500U/kg)均能夠減小血栓形成率及血栓平均長度，對血栓形成有一定的預(yù)防作用，并隨劑量的增大抑制血栓形成的作用增強，具有量效關(guān)系。 豆豉溶栓酶對小鼠肺血栓形成的影響，試驗結(jié)果為：大劑量(3000U/kg)的豆豉溶栓酶能減少小鼠癱瘓或死亡數(shù)，對