甘藍(lán)型油菜查爾酮合酶基因家族的克隆及反義轉(zhuǎn)化.pdf

1、油菜是世界四大主要油料作物之一，也是我國最為重要的油料作物之一。甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)其黃籽類型與黑籽類型相比有著許多品質(zhì)優(yōu)勢，如具有種皮色素少、種皮薄、纖維素含量低以及蛋白質(zhì)和含油量高等優(yōu)點，近年來頗受研究人員重視。甘藍(lán)型油菜黃籽形成的機(jī)理目前還不清楚，但油菜與擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)同屬于十字花科，且甘藍(lán)型油菜種皮色澤形成方式與擬南芥很相似，因此可以借鑒擬南芥透明種皮(TRANSP

2、ARENTTESTA，TT)分子生物學(xué)研究的成果開展甘藍(lán)型油菜種皮色澤分子機(jī)制的研究。
　　 查爾酮合酶(Chalcone synthase,CHS)是植物類黃酮途徑的第一個關(guān)鍵酶，參與種皮顏色、花色、莖表和葉表花青素著色等重多類黃酮相關(guān)性狀的形成，擬南芥CHS(AtCHS)被鑒定為TT4位點。研究油菜CHS基因有助于進(jìn)一步了解甘藍(lán)型油菜黃籽等諸多類黃酮相關(guān)性狀形成的分子機(jī)制，為通過分子技術(shù)修飾甘藍(lán)型油菜的這些性狀奠定基礎(chǔ)。

3、r>　　 本研究克隆了甘藍(lán)型油菜CHS基因家族8個成員的全長cDNA和6個成員的基因組序列，并對其序列及編碼蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的分析；構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜CHS基因家族反義植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化了黑籽甘藍(lán)型油菜品種中油821。主要結(jié)果如下：
　　 1.甘藍(lán)型油菜CHS基因家族成員全長cDNA和基因組序列的克隆
　　 在對多種植物的CHS基因進(jìn)行多重比對后，設(shè)計了RACE引物，以甘藍(lán)型油菜總cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增得到了12個5

4、’端序列和12個3’端序列，均與擬南芥CHS基因高度同源。據(jù)此設(shè)計相應(yīng)了5’末端引物和3’末端引物，分別從總cDNA模板中擴(kuò)增得到BnCHS1(1450bp)、BnCHS2(1430bp)、BnCHS3(1496bp)、BnCHS4(1485bp)、BnCHS5(1338bp)、BnCHS6(1314bp)、BnCHS7(1434bp)和BnCHS8(1481bp)的全長cDNA，從基因組總DNA模板中擴(kuò)增出BnCHS1(1506bp)

5、、BnCHS2(1490bp)、BnCHS3(1743bp)、BnCHS4(1752bp)、BnCHS5(1401bp)和BnCHS6(1372bp)的基因組序列，BnCHS7和BnCHS8的基因組序列暫未得到。
　　 8個BnCHS基因的結(jié)構(gòu)符合CHS基因的典型特征，且與AtCHS和其它植物CHS基因存在廣泛的同源性。
　　 2.BnCHS基因家族8個成員編碼蛋白的結(jié)構(gòu)
　　 BnCHS1編碼一個395個氨基酸

6、的多肽鏈，分子量(Mw)=43.02kDa，等電點(pI)=5.92；
　　 BnCHS2編碼一個395個氨基酸的多肽鏈，Mw=43.05kDa，pI=5.92；
　　 BnCHS3編碼一個394個氨基酸的多肽鏈，Mw=42.93kDa，pI=6.16；
　　 BnCHS4編碼一個396個氨基酸的多肽鏈，Mw=43.14kDa，pI=6.03；
　　 BnCHS5編碼一個394個氨基酸的多肽鏈，Mw=43

7、.01kDa，pI=5.92；
　　 BnCHS6編碼一個394個氨基酸的多肽鏈，Mw=43.09kDa，pI=6.29；
　　 BnCHS7編碼一個396個氨基酸的多肽鏈，Mw=43.15kDa，pI=6.61；
　　 BnCHS8編碼一個396個氨基酸的多肽鏈，Mw=43.24kDa，pI=6.41。
　　 8個BnCHS蛋白中均是酸性氨基酸含量略高于堿性氨基酸，疏水氨基酸比例為36％左右。
　

8、　 8個BnCHS蛋白序列中均有較多的潛在磷酸化位點，都沒有信號肽。預(yù)測8個BnCHS蛋白都定位于細(xì)胞漿，但卻均預(yù)測含有1～3個跨膜螺旋，說明8個BnCHS蛋白成員可能是與膜有聯(lián)系的主體位于胞漿的蛋白。
　　 8個BnCHS蛋白的二級結(jié)構(gòu)非常相似，主要含有大量的a-螺旋，隨機(jī)卷曲穿插在其中。8個BnCHS蛋白的三級結(jié)構(gòu)幾乎完全相同，并與ExPDB模型庫中的已有CHS蛋白的晶體模型相似譜有較高的一致性。
　　 8個BnC

9、HS蛋白特征與AtCHS和其它植物CHS蛋白的特征一致。
　　 3.BnCHS基因家族的同源性和進(jìn)化特征
　　 BnCHS的1～8號成員與AtCHS具有很高的同源性，基因組水平的同源性為73.2％～83.5％，ORF區(qū)域的一致性為83.4％～88.5％。變異主要是位于非編碼區(qū)，5'UTR的一致性為53.9％～69.2％，3'UTR的一致性為54.3％～69.9％，內(nèi)含子的一致性為25.5％～59.1％。
　　 B

10、nCHS1～BnCHS8與擬南芥CHS(AtCHS)的蛋白同源性都很高，氨基酸一致性分別達(dá)到95.7％、95.4％、94.7％、93.9％、86.8％、86.3％、94.9％、95.2％，相似性分別達(dá)到96.7％、96.7％、96.2％、96.2％、92.7％、91.9％、96.5％、96.7％。BnCHS家族在蛋白水平與擬南芥CHS具有比核苷酸水平高得多的一致性和相似性，氨基酸水平的變異多為相似氨基酸之間的取代，說明CHS蛋白功能保守

11、，也暗示所克隆的8個BnCHS蛋白成員應(yīng)當(dāng)具有與AtCHS相似的酶活性。
　　 系統(tǒng)發(fā)生分析表明，BnCHS基因家族是AtCHS的垂直同源基因，BnCHS基因家族的成員數(shù)符合蕓薹族基因組“三倍化”的假說，而且十字形花科祖先中很可能已經(jīng)有2條CHS基因了。這8個BnCHS基因組成4個姊妹組，每個姊妹組內(nèi)的兩個成員間的高度同源明顯高于姊妹組間的同源性，符合甘藍(lán)型油菜作為異源四倍體的特征。
　　 4.BnCHS家族反義表達(dá)載體

12、的構(gòu)建
　　 將BnCHS基因家族共保守的806bp的反義鏈片段接到中間表達(dá)載體pCambia2301G中，替換其上面的GUS基因，形成CaMV35S啟動子驅(qū)動、反義共抑制所有BnCHS成員的植物表達(dá)載體，命名為pCambia2301G-BnCHSA。
　　 5.甘藍(lán)型油菜CHS反義轉(zhuǎn)化植株的獲得
　　 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜“中油821”，獲得了27株抗卡那霉素的再生苗，通過檢測GUS基因在抗性植株中的