Orexin在體內(nèi)外對(duì)母豬下丘腦-垂體-性腺軸作用機(jī)理的研究.pdf

1、Orexin是近年發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)肽，分為orexin A和orexin B。Orexin通過(guò)其受體發(fā)揮作用，參與攝食、能量穩(wěn)態(tài)、睡眠和覺(jué)醒周期、生殖、內(nèi)臟活動(dòng)和神經(jīng)內(nèi)分泌等多種生理功能的調(diào)節(jié)。有關(guān)orexm參與生殖調(diào)控的資料大多數(shù)是在鼠上獲得的，并且相關(guān)研究較少。關(guān)于orexm在豬體內(nèi)的分布定位及其參與豬生殖調(diào)控的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以蘇種豬為研究對(duì)象，采用免疫組織學(xué)、熒光雙標(biāo)記并結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)、real time-PC

2、R和放射免疫測(cè)定(RIA)等方法研究了orexin B在豬體內(nèi)的分布定位，orexin B在前腦與GnRH和OB-Rb的形態(tài)學(xué)關(guān)系，側(cè)腦室注射orexin A后對(duì)下丘腦和垂體中相關(guān)神經(jīng)肽的表達(dá)和血清PRL、FSH、Leptin及insulin水平的影響以及體外orexin對(duì)下丘腦腦片、腺垂體和卵巢顆粒細(xì)胞GnRH、LH和E2釋放的影響，以期為orexin調(diào)控豬的生殖活動(dòng)提供形態(tài)學(xué)和生理學(xué)資料。 一、Orexin B在豬體內(nèi)的分布

3、定位 本實(shí)驗(yàn)用免疫組織化學(xué)方法研究了10頭1～2月齡蘇鐘豬腦、脊髓、部分內(nèi)臟器官和內(nèi)分泌腺內(nèi))orexin B免疫陽(yáng)性細(xì)胞的分布定位及其纖維的投射，結(jié)果如下： 1 Orexin B免疫陽(yáng)性細(xì)胞在豬前腦、腦干、脊髓、部分內(nèi)臟器官和內(nèi)分泌腺均有分布。在前腦orexin B免疫陽(yáng)性神經(jīng)元胞體主要分布于視前區(qū)、下丘腦前區(qū)、室旁核、室周核、后區(qū)、背內(nèi)側(cè)核、外側(cè)區(qū)、穹隆周核、未定帶、乳頭體核等部位。在腦干，orexin B免疫陽(yáng)性神

4、經(jīng)元分布于從中腦到延髓的許多核團(tuán)，包括前庭神經(jīng)核、藍(lán)斑、孤束核、下橄欖核和中縫蒼白核等。在脊髓，orexin B免疫陽(yáng)性神經(jīng)元胞體，分布于頸部脊髓背角。在內(nèi)臟器官，orexin B免疫陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于卵巢、睪丸、附睪、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、胰和脾臟；在內(nèi)分泌腺，主要分布于垂體和甲狀腺。 2 Orexin B免疫陽(yáng)性纖維在中樞神經(jīng)系統(tǒng)都有廣泛的分布。在端腦，orexinB免疫陽(yáng)性纖維在大腦皮質(zhì)、隔區(qū)、終紋床核、杏仁核和

5、斜角帶均有分布。大腦皮質(zhì)內(nèi)也有少量陽(yáng)性纖維分布。在間腦，主要分布于韁核、背內(nèi)側(cè)核、室周核、視上核、視交叉上核和穹隆周核，在乳頭體上核、腹內(nèi)側(cè)核、下丘腦前區(qū)、后區(qū)和弓狀核/正中隆起也有中等量分布。在腦干，前丘、后丘、腳間核、中縫背核和中央灰質(zhì)等有密集的陽(yáng)性纖維分布。在腦橋，藍(lán)斑，被蓋背側(cè)核有大量的陽(yáng)性纖維分布，在第四腦室底、極后區(qū)、臂旁內(nèi)側(cè)核有中等量的陽(yáng)性纖維分布。此外，在小腦、脊髓和垂體柄及垂體后葉也有少量的陽(yáng)性纖維的分布。 二

6、、在豬前腦orexin B與GnRH和OB-Rb的形態(tài)學(xué)關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)采用熒光雙標(biāo)記并結(jié)合激光共聚焦顯微鏡技術(shù)分析了10頭1～2月齡蘇鐘豬前腦內(nèi)orexin B與GnRH和OB-Rb之間的形態(tài)學(xué)關(guān)系。研究結(jié)果顯示：在前腦的隔區(qū)、終紋床核和整個(gè)下丘腦(包括視前區(qū)、結(jié)節(jié)區(qū)和乳頭體區(qū))，均見(jiàn)部分orexin B和GnRH在軸突中的共存；在視前區(qū)吻側(cè)部、視前外側(cè)區(qū)，GnRH神經(jīng)元胞體較大，orexin B陽(yáng)性纖維投射到GnRH神經(jīng)元的胞體

7、上；在下丘腦前區(qū)、視上核和視交叉上核存在少量的orexin B和GnRH在同一神經(jīng)元中的共存。從前腦的隔區(qū)到正乳頭體區(qū)，大約有30％左右的GnRH神經(jīng)元胞體接受orexinB免疫陽(yáng)性纖維的投射，其中有6％的是GnRH和orexin B在同一神經(jīng)元中共存。在下丘腦前區(qū)、室周核、室旁核、未定帶、外側(cè)區(qū)和腹內(nèi)側(cè)核發(fā)現(xiàn)orexin B神經(jīng)元內(nèi)有OB-Rb免疫陽(yáng)性反應(yīng)。 三、去卵巢豬側(cè)腦室微量注射orexinA對(duì)下丘腦和垂體中相關(guān)基因表達(dá)

8、的影響 為探討orexin A對(duì)生殖調(diào)控的途徑。本實(shí)驗(yàn)采用real time PCR方法，研究了10頭去卵巢蘇鐘母豬側(cè)腦室注射orexin A或生理鹽水后，對(duì)下丘腦PRL、FSH、leptin及OB-Rb mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果如下： 1、側(cè)腦室注射orexinA后，垂體內(nèi)PRL mRNA的表達(dá)顯著降低。 2、側(cè)腦室注射orexinA后，leptin及OB-Rb mRNA的表達(dá)顯著降低，而OXIR mRNA的表

9、達(dá)顯著升高，OX2R mRNA有升高的趨勢(shì)但差異不顯著。 四、去卵巢豬側(cè)腦室微量注射orexin A對(duì)血清PRL、FSH、leptin及insulin水平的影響 Orexin是攝食、能量平衡和生殖之間的信號(hào)分子，在動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和生殖之間起著橋梁作用。為此，我們研究了向去卵巢豬側(cè)腦室注射orexin A對(duì)血清PRL、FSH、leptin及insulin水平的影響。結(jié)果如下： 1、側(cè)腦室注射orexin A后，可

10、引起血清中l(wèi)eptin水平顯著下降。注射orexinA10 min后開(kāi)始下降，在30 min時(shí)降至最低，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，隨后，有所上升，但與對(duì)照組相比差異顯著。其作用可持續(xù)80 min(P<0.05) 2、側(cè)腦室注射orexinA后，可引起血液中insulin顯著升高。注射orexin A10 min后開(kāi)始上升，在30 min時(shí)升至最高，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)，隨后，有所下降，但與對(duì)照組相

11、比差異顯著。其作用可持續(xù)110 min(P<0.05) 3、側(cè)腦室注射orexin A能夠抑制血清中PRL的水平。注射10min開(kāi)始降低，注射后第40min時(shí)降到最低，與對(duì)照紐相比差異極顯著(P<0.01)。其抑制作用可持續(xù)80 min(P<0.05/) 4、側(cè)腦室注射orexin A后，血清中FSH有所上升，但差異不顯著。 五、Orexin對(duì)性成熟青年母豬下丘腦組織-垂體-卵巢軸作用的體外研究 為探討o

12、rexin在生殖調(diào)節(jié)中直接作用的靶位點(diǎn)，我們?cè)隗w外培養(yǎng)了豬下丘腦腦片、垂體和卵巢細(xì)胞，研究了orexin A和orexin B在體外對(duì)下丘腦、腺垂體和卵巢GnRH、LH和E2釋放的影響。結(jié)果顯示： 1.OrexinA(100和1000 nM)能顯著的刺激下丘腦腦片GnRH的釋放，差異極顯著(P<0.01)，而orexin B只有1000 nM劑量組能顯著刺激GnRH的釋放，差異極顯著(P<0.05)。 2.Orexin

13、A(10、100和1000 nM)均能劑量依賴性地刺激腺垂體細(xì)胞LH的釋放(P<0.05)，其中100和1000 nM劑量組與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。orexin B(100、1000 nM)也能極顯著刺激腺垂體細(xì)胞LH的釋放(P<0.01)。 3.OrexinA(10、100和1000 nM)均能顯著刺激卵巢顆粒細(xì)胞E2的釋放，100nM劑量對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞E2的釋放的刺激作用最強(qiáng)，1000nM劑量組的刺激作用反而

14、比100nM劑量組相比的有所下降。Orexin B100和1000nM劑量組能顯著的刺激卵巢顆粒細(xì)胞E2的釋放(p<0.05)，其中1000 nM劑量組與對(duì)照組相比，差異極顯著(p<0.01)。 上述研究表明，orexin B在豬下丘腦、垂體和卵巢均有分布，為orexm參與生殖調(diào)控提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)。Orexin B在豬前腦與GnRH和OB-Rb有共存，提示Orexin參與生殖活動(dòng)的調(diào)節(jié)可能是直接作用于GnRH神經(jīng)元發(fā)揮作用也可能

15、是經(jīng)由leptin介導(dǎo)。側(cè)腦室注射orexinA后，orexin能抑制下丘腦和垂體中PRL、leptin及OB-Rb mRNA的表達(dá)，可促進(jìn)OXIR mRNA的表達(dá)，并降低血清中PRL、leptin和升高血清胰島素的水平。體外試驗(yàn)研究表明orexin A和orexin B能夠刺激下丘腦腦片GnRH、腺垂體和卵巢顆粒細(xì)胞LH和E2的釋放。這些結(jié)果表明orexin既可直接影響生殖相關(guān)激素的分泌和釋放，又可能通過(guò)leptin及胰島素等攝食相關(guān)