LPE對(duì)五種致齲菌生長及表兄鏈球菌相關(guān)酶活性的影響.pdf

1、目的:牙菌斑生物膜是齲病發(fā)生的基礎(chǔ)。變異鏈球菌、表兄鏈球菌和內(nèi)氏放線菌等是構(gòu)成牙菌斑生物膜的主要致齲菌。細(xì)菌通過疏水作用吸附于牙釉質(zhì)表面的獲得性膜，利用葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化基質(zhì)中的蔗糖合成葡聚糖，葡聚糖可誘導(dǎo)牙面上細(xì)菌的粘附和聚集，促進(jìn)牙菌斑形成。牙菌斑中的細(xì)菌代謝產(chǎn)酸，主要是無氧酵解中乳酸脫氫酶催化丙酮酸生成乳酸，酸的累積造成牙釉質(zhì)的局部脫礦，導(dǎo)致齲損形成。本課題組在國內(nèi)外首先開展檸檬提取物(Lemonpeelextract，LPE)防齲

2、的系列研究，LPE是由水果檸檬中提取的一種淡黃色液體，主要成分是檸檬烯及其同分異構(gòu)體(占總含量的79％)。本實(shí)驗(yàn)通過研究LPE對(duì)5種致齲菌(變異鏈球菌、血鏈球菌、表兄鏈球菌、內(nèi)氏放線菌、嗜酸乳桿菌)的生長抑制作用，對(duì)表兄鏈球菌致齲相關(guān)酶(葡糖基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶)的活性及代謝產(chǎn)物(水不溶性多糖)的抑制作用，探討LPE抑制口腔致齲菌生長，抑制表兄鏈球菌的附著性、代謝產(chǎn)酸的作用機(jī)制，同時(shí)分析代謝酶在細(xì)菌致齲作用中的意義。
　　方法:<

3、br>　　1.LPE提取及成分分析
　　采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，在一定的色譜質(zhì)譜條件下，測得檸檬揮發(fā)油成分GC-MS總離子流色譜圖(TIC)。根據(jù)檢索NIST2008譜庫，按峰面積歸一化法進(jìn)行定量，求得各組分的相對(duì)含量。
　　2.LPE對(duì)五種口腔致齲菌生長的影響
　　本實(shí)驗(yàn)選取變異鏈球菌、表兄鏈球菌、嗜酸乳桿菌、血鏈球菌、內(nèi)氏放線菌為實(shí)驗(yàn)菌株，采用液體稀釋法測定最小抑菌濃度(minimalinhibitorycon

4、centration，MIC)；根據(jù)MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果，配置含LPE的TPY液體培養(yǎng)基。將菌懸液(1×108CFU/ml)與TPY液體培養(yǎng)基按體積比1:10比例接種，置于恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱中37℃厭氧培養(yǎng)。分別于0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、18h、24h提取菌液，采用菌落計(jì)數(shù)法檢測LPE對(duì)五種細(xì)菌生長的影響。以活菌數(shù)(lgCFU/ml)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，作圖繪制生長曲線。
　　3.LPE對(duì)表兄鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性和細(xì)胞

5、外不溶性多糖含量的影響采用二倍稀釋法，用TPY液體培養(yǎng)基將LPE稀釋為2.25mg/ml、1.125mg/ml、0.563mg/ml和0.28mg/ml4個(gè)濃度的溶液(MIC為4.5mg/ml)，以TPY液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組。采用菌落計(jì)數(shù)法檢測MIC以下四個(gè)濃度LPE對(duì)表兄鏈球菌生長曲線的影響。用Neson-Somogyi法測定培養(yǎng)6h、18h、24h和48h培養(yǎng)液中還原糖的含量，計(jì)算出葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyltransfer

6、ase，GTF)活性；采用蒽酮法測定水不溶性多糖(Waterinsolubleglucan，WIG)的含量，并對(duì)GTF活性與WIG含量的關(guān)系做相關(guān)性分析。
　　4.LPE對(duì)表兄鏈球菌乳酸脫氫酶活性和產(chǎn)酸的影響
　　分組設(shè)計(jì)同上。采用還原性輔酶I氧化法，測定LPE對(duì)表兄鏈球菌乳酸脫氫酶(Lactatedehydrogenase，LDH)活性的影響，同時(shí)用FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)測定用藥前后培養(yǎng)液中pH值的變化(△pH=初始pH值-

7、終末pH值)，以檢測LPE對(duì)表兄鏈球菌產(chǎn)酸能力的抑制作用，并對(duì)LDH活性和細(xì)菌代謝產(chǎn)酸能力的關(guān)系做相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　1.從檸檬提取物氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖(TIC)中，共檢測出100余個(gè)色譜峰，鑒定了其中的40個(gè)色譜峰，其含量占揮發(fā)油總量的93.954％。主要成分是檸檬烯，β-蒎烯，4-皆烯等。
　　2.LPE對(duì)五種口腔致齲菌的MIC分別是：變異鏈球菌、血鏈球菌、表兄鏈球菌的MIC為4.5mg/ml，

8、嗜酸乳桿菌和內(nèi)氏放線菌的MIC為2.25mg/ml。在致齲菌的MIC作用下，從0.5h到2.4h，隨作用時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組菌量逐漸減少。選取0、0.5h、1h、2h四個(gè)時(shí)點(diǎn)，對(duì)各菌組的實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，變異鏈球菌、血鏈球菌、內(nèi)氏放線菌、嗜酸乳桿菌、表兄鏈球菌的實(shí)驗(yàn)組與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　3.菌落計(jì)數(shù)法測量MIC以下四個(gè)濃度LPE對(duì)表兄鏈球菌生長的影響。從0.281mg/ml組到2

9、.25mg/ml組，隨著LPE溶液濃度的升高，在0h、0.5h、1h、2h、4h、6h、18h、24h、48h，與空白對(duì)照組比較，LPE對(duì)表兄鏈球菌的生長有抑制作用。在同一時(shí)間點(diǎn)，隨著LPE溶液濃度的升高，表兄鏈球菌的GTF活性及胞外WIG含量逐漸降低，除低濃度組0.563mg/ml和0.281mg/ml外，各組還原糖量及酶活性均數(shù)間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；各濃度組與空白對(duì)照組GTF活性及WIG勻數(shù)之間比較，差異均有統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同一濃度下，各時(shí)間點(diǎn)(48h除外)(濃度組-空白對(duì)照組)酶活性與WIG含量的總體均數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，空白對(duì)照組酶活性的總體均數(shù)在6h、18h與24h間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？瞻讓?duì)照組WIG含量的總體均數(shù)在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。GTF活性和WIG含量之間呈正相關(guān)(r=0.865～0.94)。
　　4.在同一時(shí)間點(diǎn)，隨著LPE溶液濃度

11、的升高，從0.281mg/ml組到2.25mg/ml組，LDH活性和△pH逐漸降低，各實(shí)驗(yàn)組均數(shù)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組酶活性、△pH比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同一濃度下，各時(shí)間點(diǎn)，(濃度組-空白對(duì)照組)乳酸脫氫酶活性和△pH的總體均數(shù)在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。乳酸脫氫酶活性和△pH值之間呈正相關(guān)(r=0.926～0.982)。
　　結(jié)論:

12、　　1.本研究提取并使用的LPE，主要成分以烯類化合物為主，占總含量79％，主要有：檸檬烯(48％)、β-蒎烯(17％)等。
　　2.LPE對(duì)變異鏈球菌(MIC4.5mg/ml)、血鏈球菌(MIC4.5mg/ml)、表兄鏈球菌(MIC4.5mg/ml)、內(nèi)氏放線菌(MIC2.5mg/ml)、嗜酸乳桿菌(MIC2.5mg/ml)的生長有抑制作用。
　　3.LPE在MIC以下四個(gè)濃度，從0.281mg/ml至2.25mg/ml，

13、對(duì)表兄鏈球菌GTF和WIG的合成均具有抑制作用，隨著藥物濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)。
　　4.LPE在MIC以下四個(gè)濃度，從0.281mg/ml至2.25mg/ml，對(duì)表兄鏈球菌LDH活性及影響糖代謝產(chǎn)酸能力均具有抑制作用，隨著藥物濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)。
　　5.LPE對(duì)表兄鏈球菌GTF和WIG合成的抑制作用最佳時(shí)間段為18h～24h。
　　6.LPE在低于MIC以下的四個(gè)濃度(0.281mg/ml、0.563mg/