桑樹2個功能基因及啟動子的克隆和表達模式分析.pdf

1、桑樹作為一種重要的經(jīng)濟作物，幾千年以前就已被我國勞動人民所用，并且我國擁有世界上最豐富的桑樹種質(zhì)資源。但是，對桑樹功能基因的研究卻仍處于起步階段，使桑樹的產(chǎn)量很大程度受到病蟲害和各種逆境條件的影響。因此，研究桑樹一些重要的功能基因及其在非生物脅迫條件下的分子作用機制，可以增強桑樹對各種脅迫條件的抗逆性，對提高桑葉產(chǎn)量和桑樹種質(zhì)資源的保存具有重要意義。
　　本文從已構(gòu)建的桑樹幼葉cDNA文庫中獲得了2個ESTs序列，并根據(jù)這二個已知

2、的ESTs序列設(shè)計相關(guān)的特異性引物，結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到了這2個基因的完整cDNA序列，并對獲得的全長序列進行了生物信息學分析和功能預(yù)測，利用脅迫誘導(dǎo)和熒光定量PCR的方法對這2個功能基因進行了功能驗證。本論文針對這2個基因所做的主要研究內(nèi)容如下：
　　1、桑樹磷脂酰肌醇4,5二磷酸基因和啟動子的克隆、序列分析及誘導(dǎo)表達分析
　　從已構(gòu)建的桑樹幼葉cDNA文庫得到了一個編碼桑樹磷脂酰肌醇4,5二磷酸(pho

3、sphatidylinositol(4,5)-bisphosphate,PIP2)基因的一段序列，通過RT-PCR首次獲得了這個基因的完整序列，并將其命名為MmPIP2（GenBank登錄號:JN716318）。序列分析表明，該基因序列全長1079 bp，存在102 bp的5’端非翻譯序列（5’-UTR）和128 bp的3’端非翻譯序列（3’-UTR），其開放讀碼框（ORF）長849 bp，編碼282個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為29.

4、87 kD，等電點為8.91。同時以魯桑品種育71-1基因組DNA為模版,克隆得到PIP2基因的啟動子片段。采用啟動子序列分析軟件PLACE中的plant care軟件對其進行序列結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示啟動子片段含有核心啟動子序列，除典型的TATA-box、GATA-box以及CAAT-box等保守元件外，還有許多其他重要作用元件如AE-box、I-box和ABRE等。定量PCR結(jié)果表明，與正常生長環(huán)境相比，MmPIP2基因和啟動子mRNA

5、的轉(zhuǎn)錄水平在干旱、低溫、PEG-6000模擬干旱脅迫和鹽脅迫以及抗病感病幾種條件下均有所變化。
　　2、桑樹核糖體蛋白S3a基因的克隆、序列分析及誘導(dǎo)表達研究
　　從已構(gòu)建的桑樹幼葉cDNA文庫得到了一個編碼桑樹核糖體蛋白S3a(Ribosomal protein S3a，RPS3a)基因的一段序列，通過RACE與RT-PCR結(jié)合的方法首次獲得了該基因的完整序列，并命名為MmRPS3a。序列分析表明，MmRPS3a全長108

6、9 bp，包含80bp的5’端非翻譯序列（5’-UTR）和220bp的3’端非翻譯序列（3’-UTR），其開放閱讀框（ORF）長789bp，編碼262個氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為30.053 kD，等電點為9.84。同源分析表明，MmRPS3a基因在桑樹與川桑、可可樹、蓖麻等各物種間具有很高的保守性?；谏浜推渌?5個物種RPS3a基因的系統(tǒng)進化分析表明，魯桑與碧桃、擬南芥、馬鈴薯、番茄、葡萄的關(guān)系較近。定量PCR結(jié)果表明，MmRP