低血清濃度培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞特性及其對(duì)人Th細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景：間充質(zhì)干細(xì)胞(multipotent mesenchymal stem cells，MSC)是一種存在于多種組織中的具有自我更新和多向分化能力的多能干細(xì)胞。MSC具有易于分離和擴(kuò)增、多向分化、低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)的特性，這些特性使它們成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的理想種子細(xì)胞。細(xì)胞治療中的一個(gè)重要問(wèn)題是MSC替代來(lái)源的的可獲得性，而細(xì)胞治療的成功的決定性因素則是MSC的生物學(xué)特性。對(duì)MSC生物學(xué)特性的理解有利于充分的利用MSC的治療潛能

2、，因此，MSC生物學(xué)特性的研究越來(lái)越引起人們的興趣。到目前為止，大多數(shù)的治療性應(yīng)用是以成體骨髓來(lái)源的MSC為研究對(duì)象，但是成體骨髓MSC存在骨髓體積有限，獲取標(biāo)本時(shí)需進(jìn)行侵襲性操作以及MSC的絕對(duì)數(shù)量和分化能力會(huì)隨著年齡增加而下降等不足。這就需要研究人員尋找替代的MSC細(xì)胞來(lái)源，同時(shí)，研制良好的細(xì)胞培養(yǎng)試劑為MSC的生長(zhǎng)和擴(kuò)增提供適合的環(huán)境，從而滿(mǎn)足臨床治療和研究方面的需求。 目的：本研究旨在鑒定低血清濃度完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSC

3、的一般特性如形態(tài)、核型、增殖動(dòng)力學(xué)、表型特點(diǎn)和分化潛能等生物學(xué)性狀，從而提供一種MSC的培養(yǎng)試劑并為MSC作為組織工程的種子細(xì)胞提供理論基礎(chǔ)。 方法： ①應(yīng)用貼壁培養(yǎng)的方法從胎兒的骨髓和肺組織以及臍帶中分離獲得單個(gè)細(xì)胞，在低血清完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，除去非貼壁的細(xì)胞、通過(guò)體外傳代培養(yǎng)使細(xì)胞純化。 ②測(cè)定培養(yǎng)的MSC的核型和生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 ③應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)的MSC進(jìn)行細(xì)胞周期分析。 ④運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)

4、檢測(cè)MSC的免疫表型和胚胎干細(xì)胞的全能標(biāo)志物。 ⑤在誘導(dǎo)體系中定向誘導(dǎo)MSC向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化，利用油紅0、茜素紅和阿爾新藍(lán)染色觀測(cè)脂滴形成、鈣鹽沉積和酸性粘多糖合成情況；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)系分化特異性標(biāo)志物過(guò)氧化物酶體增生物激活受體—γ(PPAR—γ)、骨鈣蛋白(osteocalcin)和Ⅱ型膠原的表達(dá)。 ⑥采用兩步誘導(dǎo)方案使骨髓和肺組織來(lái)源的MSC體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)

5、胞中的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白2(microtubule—associated protein 2，MAP2)、Nestin和神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表達(dá)。 ⑦采用兩步誘導(dǎo)方法使肺組織來(lái)源的MSC體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，利用RT-PCR方法檢測(cè)誘導(dǎo)細(xì)胞中的肝細(xì)胞標(biāo)志物如甲胎蛋白(αFP)、白蛋白(albumin)和細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin18，C

6、K18)的表達(dá)；利用糖原染色和培養(yǎng)上清中白蛋白的分泌水平對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行功能性檢測(cè)。 結(jié)果： ①低血清濃度完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSC貼壁生長(zhǎng)和呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，細(xì)胞融合時(shí)出現(xiàn)漩渦狀外觀。 ②MSC具有正常核型以及典型的“S”型生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 ③細(xì)胞周期表明大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期，少部分的細(xì)胞處于活躍增殖期。 ④MSC高表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如CD13，CD29，CD44，CD90，CD49e，C

7、D105，CD166和HLA—Ⅰ，而不表達(dá)造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，如CD31、CD34、CD11b、CD45、CD117，CD133和HLA—Ⅱ。更重要的是，表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4，Nanog，Sox2和SSEA—4，其中傳代到第25代(P25)的肺組織來(lái)源的MSC仍可保持免疫表型和胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的穩(wěn)定。 ⑤MSC經(jīng)誘導(dǎo)后，油紅0、茜素紅和阿爾新藍(lán)染色均為陽(yáng)性，且高表達(dá)系分化特異性標(biāo)志物，說(shuō)明其能夠分化為脂肪細(xì)胞

8、、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，其中肺組織來(lái)源的MSC能保持其三系分化能力到P25。 ⑥神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物在誘導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于其在對(duì)照細(xì)胞中的水平。 ⑦與對(duì)照細(xì)胞相比，肝細(xì)胞標(biāo)志物在誘導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)；誘導(dǎo)后細(xì)胞具有儲(chǔ)存糖原和分泌白蛋白的功能。 結(jié)論： ①低血清濃度完全培養(yǎng)基是一種很好的培養(yǎng)MSC的細(xì)胞試劑。 ②利用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSC具有較強(qiáng)增殖能力，可滿(mǎn)足組織工程種子細(xì)胞的需要。 ③利用該