水稻系統(tǒng)獲得抗性基因OsSRT2的克隆及功能分析.pdf

1、人們通過基因工程技術(shù)發(fā)掘了一批擁有一定針對性的抗病基因，這些基因可以作為一個(gè)復(fù)雜的基因防御體系保護(hù)水稻植株免于細(xì)菌、真菌、病毒以及線蟲病原菌的侵染?？共』蛟谥参矬w內(nèi)編碼的產(chǎn)物可以特異性地識別不相容的病原體，引發(fā)一系列級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致宿主發(fā)生抗病反應(yīng)。一種小分子的植物激素—水楊酸（SA）在植物抗病過程中扮演著重要的作用。病原體應(yīng)答性的水楊酸生物合成被認(rèn)為是受到PAD4、EDS5以及SID2控制的。而PAD4、EDS5、SID2的病原誘導(dǎo)表

2、達(dá)在擬南芥中會被AtSRT2抑制,說明AtSRT2在調(diào)節(jié)SA合成方面有重要作用。水稻中含有AtSRT2的同源基因—OsSRT2，它們都屬于沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Silent information regulator2，Sir2）蛋白。Sir2自首次在酵母中被克隆出來以來，其同源物在一些哺乳動物中被相繼被克隆，然而我們對植物中Sir2家族的作用卻知之甚少。
　　為了探究Sir2類型蛋白在水稻系統(tǒng)獲得抗性中所扮演的角色，我們研究了Os

3、SRT2的亞細(xì)胞定位情況；轉(zhuǎn)基因植株中的基因表達(dá)量及其與抗性誘導(dǎo)相關(guān)水楊酸含量的關(guān)系；轉(zhuǎn)基因植株對白葉枯病病菌的抗性情況等。具體如下：
　　1．從水稻日本晴cDNA中克隆出SAR信號途徑的關(guān)鍵基因OsSRT2，序列分析顯示該其基因 cDNA的全長為938 bp的OsSRT2基因編碼的蛋白質(zhì)分子量Mw=34.56kD，等電點(diǎn)pI=8.76。與NCBI已登錄的水稻SRT2基因同源性為99％，蛋白質(zhì)序列同源性100%，說明SRT2在物種

4、進(jìn)化過程中核苷酸發(fā)生了同義突變，而蛋白質(zhì)水平的進(jìn)化較保守。
　　2.為了發(fā)現(xiàn)OsSRT2基因的作用部位，推測OsSRT2作用方式提供依據(jù)。通過基因槍，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化35S-OsSRT2-GFP融合表達(dá)質(zhì)粒到洋蔥表皮細(xì)胞，在熒光顯微鏡下檢測亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果可見OsSRT2定位于細(xì)胞核內(nèi)。
　　3.構(gòu)建了OsSRT2的過量表達(dá)載體和RNAi干涉載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)導(dǎo)入水稻內(nèi)，共記獲得9株T1代過表達(dá)陽性植株，8株T1代干涉陽性

5、植株。對獲得的轉(zhuǎn)基因植株T1代體內(nèi)游離態(tài)水楊酸（SA）含量進(jìn)行HPLC測定，OsSRT2過表達(dá)植株體內(nèi)水楊酸的含量明顯低于對照；而OsSRT2RNAi植株體內(nèi)自由態(tài)水楊酸的含量大約是對照的1.5倍。說明OsSRT2參與調(diào)節(jié)SA在植株體內(nèi)的積累，抑制植株體內(nèi)的SA含量，從而間接證明了OsSRT2參與SA介導(dǎo)的抗病信號過程。
　　4.對轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的水楊酸誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，過表達(dá)植株中OsSRT2的含量高于野生

6、型兩倍多，在SA處理后有一定下降，但依舊維持在較高的水平。而干涉植株的OsSRT2的含量大約為野生型的1/2，在SA處理后也有一定下降，處于一個(gè)較低的表達(dá)水平。
　　5.在劍葉期分別對OsSRT2過表達(dá)，OsSRT2-RNAi及野生型的日本晴植株進(jìn)行白葉枯病病原菌接種鑒定，結(jié)果顯示：OsSRT2-RNAi的抗病能力明顯提高，而OsSRT2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻水稻更易感病。
　　上述表明克隆的OsSRT2基因通過負(fù)調(diào)控作用與水稻的