干旱脅迫下黃檗消減文庫的構(gòu)建及Ⅱ型MT基因的克隆.pdf

1、黃檗是古熱帶區(qū)孑遺植物，經(jīng)歷了從第三紀(jì)炎熱到寒冷等一系列的氣候變遷，對自然界的非生物脅迫(如高溫、干旱、寒冷)有很強(qiáng)的適應(yīng)力，為國家二級保護(hù)植物。 為研究干旱脅迫下黃檗的基因表達(dá)情況，本論文以干旱脅迫下的黃檗幼苗cDNA為tester，正常生長的黃檗幼苗組織cDNA為driver，利用抑制性消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization，SSH)構(gòu)建了干旱脅迫下黃檗幼苗的消減文庫。從消減

2、文庫中隨機(jī)挑取20個(gè)陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和PCR鑒定，顯示文庫克隆的重組率大于95％，插入片段大部分集中在300～800bp之間。隨機(jī)挑取816個(gè)克隆進(jìn)行測序，得到265個(gè)基因。將其進(jìn)行同源性分析，將其劃分為16類，獲得了如熱激蛋白70、脫水響應(yīng)蛋白(RD22)、通用脅迫蛋白、金屬硫蛋白(MT2)，晚期胚胎豐富蛋白(LEA14)等44種與干旱脅迫相關(guān)的基因，它們涉及了植物的滲透調(diào)節(jié)、信號傳遞、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、活性氧清除等方面。所得160

3、個(gè)EST序列已被GenBank和EST數(shù)據(jù)庫收錄。 從文庫中選取金屬硫蛋白基因(MT2)進(jìn)一步研究，根據(jù)測序得到的序列設(shè)計(jì)MT2特異性引物，通過5’cDNA末端快速擴(kuò)增(RLM-RACE)技術(shù)克隆了其5’端序列。將5’RACE產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體后，轉(zhuǎn)化測序，并根據(jù)測序結(jié)果重新設(shè)計(jì)引物，克隆了MT2編碼區(qū)序列，從而得到了MT2的全長序列。黃檗MT2基因mRNA全長852bp，ORF分析表明，其在112bp處具有起始密碼子A

4、TG，315bp處有終止密碼子TGA，具有240bp的完整的開放讀碼框，預(yù)測編碼79個(gè)氨基酸。經(jīng)過Blast分析，發(fā)現(xiàn)它在核酸序列上與柑橘、柳樹類MT序列有80％的序列同源性，且同源區(qū)域覆蓋cDNA100％；其假定氨基酸序列與柳樹類MT2A蛋白在55個(gè)氨基酸序列中有70％的同源性，說明黃檗金屬硫蛋白與已知MT有明顯的同源性，可以預(yù)測其具有與己知MT類似的功能。 綜上所述，利用SSH技術(shù)構(gòu)建了黃檗幼苗在干旱脅迫下差異表達(dá)基因文庫，