肢體缺血再灌注大鼠腦組織中iNOS、nNOS、eNOS的mRNA表達及其意義.pdf

1、背景:肢體缺血再灌注損傷(LIRI)是臨床中經(jīng)常發(fā)生的病理過程，如斷肢再植術(shù)、肢體外出血使用止血帶、嚴(yán)重的擠壓傷后、大血管栓塞再通或損傷修復(fù)等，均可造成以肢體損傷為中心的多臟器損傷，甚至多器官功能障礙，使肢體缺血再灌注損傷成為臨床肢體血運重建后出現(xiàn)意外致殘、致死的主要原因之一。肢體缺血再灌注造成遠(yuǎn)隔器官損傷的病理機制目前尚未明確，已證實中性粒細(xì)胞和氧自由基參與介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激與此有重要關(guān)系。其中氧自由基既可以造成組織細(xì)胞的脂質(zhì)過

2、氧化，還可以引起一系列的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷，是一種非常重要的損傷因素。一氧化氮(NO)作為生物體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子，是迄今發(fā)現(xiàn)的與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)的兩個氣體信使分子之一。體內(nèi)NO的半衰期短，生物作用完全依賴一氧化氮合酶(NOS)，所以NOS是NO合成的關(guān)鍵酶。目前研究證實NOS-NO參與了肢體長時間缺血再灌注后的腦組織損傷過程，其中誘導(dǎo)型NOS(iNOS)有明顯時間含量改變規(guī)律。是否神經(jīng)元型NOS(nNOS)和內(nèi)皮

3、型NOS(eNOS)也存在如此的變化?目前國內(nèi)外并未見相關(guān)研究文獻。 目的:通過建立大鼠后肢缺血再灌注模型，觀察腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，運用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定腦組織中三種一氧化氮合酶亞型的時-量變化和通過比色法測定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的時-量變化，最終支持長時間肢體缺血后再灌注血流對腦組織的不良影響，觀察不同亞型的NOS在此過程中的時-量變化特點，探討不同亞型NOS在氧化應(yīng)激過程中的作用傾

4、向。 方法:實驗選用2月齡SD雄性大鼠56只，體重220.51～250.50g，平均226.90±8.44g，組間比較其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。56只SD大鼠隨機分為正常組、實驗組： (1)正常組(N n=8)直接將大鼠用水合氯醛(5ml/kg)腹腔注射麻醉后，頭頂相應(yīng)區(qū)域剪毛，絡(luò)合碘消毒，直接開顱剝離取出一側(cè)大腦半球，超低溫保存； (2)實驗組(I/R n=48)建立雙后肢缺血4小時模型后，再分為再灌注2小時、4小時

5、、6小時、8小時、16小時和24小時6組，每組8只。麻醉后取一側(cè)大腦半球，超低溫保存。實驗結(jié)束后，光鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變，測定腦組織中iNOS、nNOS、eNOS各時間點的mRNA半定量表達和MDA含量、總SOD活性的變化，分析iNOS、nNOS、eNOS、MDA與SOD的相關(guān)性。 結(jié)果: 1、以各指標(biāo)條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為iNOS、nNOS和eNOS的mRNA半定量結(jié)果。正常腦組織中有少量i

6、NOS、nNOS和eNOS表達，缺血再灌注2小時后均出現(xiàn)表達增強，其中iNOS缺血再灌注4小時表達到高峰，nNOS、eNOS在缺血再灌注6小時后表達達高峰，三型NOS缺血再灌注24小時均再次出現(xiàn)高表達。實驗結(jié)果以x±S表示，實驗組各時間點結(jié)果與正常組比較，差異有顯著性意義。 2、正常組和實驗組各時間點比較，隨缺血再灌注時間延長SOD活力顯著降低，MDA含量則顯著增高。SOD最低值出現(xiàn)在缺血再灌注4小時組，MDA最高值出現(xiàn)在缺血再

7、灌注4小時組。與正常組比較，差異有顯著性意義。 3、以腦組織總SOD活力為應(yīng)變量，檢驗水準(zhǔn)α=0.05(雙側(cè))。腦組織總SOD活力與MDA含量(r=-0.475)，iNOS(r=-0.304)，nNOS(r=-0.415)，eNOS(r=-0.31)均呈顯著負(fù)相關(guān)。 4、光鏡下觀察IR 4h、24h組，腦組織水腫，神經(jīng)元受損最嚴(yán)重。大腦皮質(zhì)部份神經(jīng)元胞體、胞核增大，胞漿及核密度下降，部分神經(jīng)元核仁消失；錐體細(xì)胞明顯變小，

8、著色加深，細(xì)胞周圍出現(xiàn)水腫裂隙。 結(jié)論: 1、肢體缺血再灌注后，腦組織損傷的發(fā)生與氧化應(yīng)激有直接關(guān)系。由MDA和SOD的時-量變化規(guī)律可證實，此氧化應(yīng)激損傷在I/R 4h最嚴(yán)重。 2、NOS作為NO的關(guān)鍵酶，其三種亞型合酶在缺血再灌注的不同時間點，也存在不同的含量表達變化規(guī)律。其中iNOS的高表達時間早于nNOS和eNOS，且三種亞型NOS均有兩個表達高峰，可認(rèn)為肢體的缺血再灌注對腦組織的損傷以IR 4h和24h