一種抗腫瘤蛋白基因在衣藻葉綠體中的重組與表達(dá).pdf

1、本研究于1998年從藍(lán)藻中克隆獲得了別藻藍(lán)蛋白基因(apc)。將該基因重組到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒PET28a+中，實(shí)現(xiàn)了該基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)。但在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白存在后期的分離純化繁瑣，需要包涵體復(fù)性以及含有大腸桿菌毒素等不利因素。由于rAPC口服給藥有效，這提示可以開(kāi)發(fā)一種直接口服的治療癌癥的新藥。我們選擇了用衣藻葉綠體表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)這種藥用蛋白。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)口服抗腫瘤藥用蛋白奠定基礎(chǔ)。本論文研究的第一部分探索了進(jìn)行衣藻葉

2、綠體轉(zhuǎn)化所涉及的各種方法，如：基因槍轉(zhuǎn)化參數(shù)、篩選方法及對(duì)轉(zhuǎn)化子的各種分子檢測(cè)方法等。通過(guò)對(duì)以上方法的探索，初步建立了利用同源重組方法在衣藻葉綠體中穩(wěn)定表達(dá)外源基因的體系?！　”菊撐难芯康牡诙糠謽?gòu)建了外源基因apc的衣藻葉綠體表達(dá)載體：papc-S，并用基因槍法將該載體導(dǎo)入衣藻細(xì)胞，通過(guò)抗性篩選后，在壯觀霉素抗性平板上得到了15個(gè)墨綠色的衣藻轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過(guò)三輪抗性篩選后，利用一對(duì)分別互補(bǔ)于衣藻葉綠體chlL基因5’端和外源基因apc3

3、’端的引物對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了PCR檢測(cè)，同時(shí)以apc基因?yàn)樘结槍?duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了酶切Southern檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)外源基因已經(jīng)定點(diǎn)整合到了衣藻葉綠體特定位點(diǎn)?！　∮捎谠诖竽c桿菌中重組的別藻藍(lán)蛋白β亞基的抗腫瘤活性大大高于完整的重組的APC蛋白。因此論文研究的第三部分構(gòu)建了別藻藍(lán)蛋白β亞基的衣藻葉綠體表達(dá)載體papc-B。用基因槍法將之導(dǎo)入衣藻細(xì)胞后，經(jīng)各種分子水平的檢測(cè)證實(shí)別藻藍(lán)蛋白β亞基在衣藻中獲得了表達(dá)，表達(dá)蛋白水平占衣藻可溶性總蛋白的3