RNAi抑制HIF-1α表達(dá)對(duì)腫瘤糖代謝影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 HIF-1α在胃癌及胰腺癌中的表達(dá)
　　目的：研究 HIF-1α在胃癌和胰腺癌組織中的表達(dá)以及與臨床病理之間的關(guān)系。
　　方法：通過免疫組織化學(xué)和Western Blot的方法檢測(cè)50例胃癌和50例胰腺癌組織中HIF-1α蛋白的表達(dá);通過Realtime PCR的方法檢測(cè)HIF-1α mRNA在胃癌和胰腺癌組織中的表達(dá)，并分析HIF-1α的表達(dá)與胃癌和胰腺癌臨床病理之間的關(guān)系

2、。
　　結(jié)果：HIF-1αmRNA和蛋白在胃癌和胰腺癌組織中均存在高表達(dá)，與癌旁正常組織相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。胃癌組織中HIF-1α的表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān);胰腺癌組織中HIF-1α的表達(dá)與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　結(jié)論：HIF-1α在胃癌及胰腺癌組織中均存在著高表達(dá)。HIF-1α的表達(dá)與胃癌和胰腺癌的病理分期有關(guān)。
　　第二部分 RNAi抑制HIF-1α表達(dá)對(duì)胰腺

3、癌細(xì)胞及糖代謝影響的體外實(shí)驗(yàn)
　　第一節(jié) HIF-1α基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建
　　目的：構(gòu)建針對(duì)HIF-1α基因表達(dá)的RNA干擾靶向沉默慢病毒載體。
　　方法：針對(duì)HIF-1α基因核苷酸序列設(shè)計(jì)干擾片段，和載體連接構(gòu)建shRNA表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序，隨后通過慢病毒載體感染胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，進(jìn)行感染效率測(cè)定，最后利用定量PCR和Western Blot方法鑒定目的基因表達(dá)。
　　結(jié)果

4、：酶切簽定、陽(yáng)性克隆質(zhì)粒測(cè)序、定量PCR和Western Blot測(cè)定HIF-1α表達(dá)結(jié)果說(shuō)明該RNAi慢病毒載體對(duì)目的基因具有較好的干擾效果。
　　結(jié)論：靶向HIF-1α基因的RNAi慢病毒載體構(gòu)建成功。
　　第二節(jié) HIF-1α基因沉默對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞及糖代謝影響的體外實(shí)驗(yàn)
　　目的：探討HIF-1α基因沉默對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和凋亡的影響;探討HIF-1α對(duì)胰腺癌細(xì)胞糖代謝的調(diào)控作用。
　　方法：

5、實(shí)驗(yàn)分干擾組、GFP對(duì)照組、空白對(duì)照組，分別進(jìn)行兩種處理:正常培養(yǎng)、缺氧培養(yǎng)。利用MTT實(shí)驗(yàn)繪制胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwll實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲;利用乳酸試劑盒測(cè)定乳酸含量;利用定量PCR和Weste Blot方法測(cè)定PDK1、LDHA、PKM2和CS的表達(dá)，觀察HIF-1α沉默前后相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果：缺氧條件下，HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯升高，乳酸的生成、糖代謝酶PDK1、L

6、DHA、PKM2 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯升高，同有氧條件下比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); CS mRNA和蛋白的表達(dá)同有氧條件下比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。缺氧條件下，HIF-1α基因沉默后，乳酸的生成、糖代謝酶PDK1、LDHA、PKM2 mRNA和蛋白的表達(dá)均受到明顯抑制，與空載體組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); CS mRNA和蛋白的表達(dá)沒有受到明顯影響，與空載體組比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0

7、.05)。缺氧條件下，HIF-1α基因沉默后，胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，凋亡率升高，細(xì)胞侵襲受到抑制，同空載體組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。
　　結(jié)論：在缺氧條件下，HIF-1α的表達(dá)明顯增強(qiáng)，它可能通過上調(diào)其下游糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤的糖酵解代謝;HIF-1α沉默在體外能抑制胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，使其凋亡率升高。
　　第三部分 RNAi抑制HIF-1α表達(dá)裸鼠成瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)