血清抗hTERT自身抗體作為癌癥診斷標(biāo)志物的初步研究.pdf

1、目的：通過構(gòu)建人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶中段(hTERT-m)、C-端(hTERT-c)蛋白原核表達(dá)系統(tǒng),并分離提純獲得高純度的hTERT-m和hTERT-c蛋白,以此兩種蛋白為抗原利用間接ELISA技術(shù)檢測癌癥患者血清抗hTERT自身抗體水平,為血清抗hTERT自身抗體能否作為一項新的腫瘤標(biāo)志物提供實驗依據(jù)。
　　方法：1.質(zhì)粒載體pMAL-c5X和重組質(zhì)粒pMAL-p5X-hTERT-m、pMAL-p5X-hTERT-c經(jīng)限制性內(nèi)切酶B

2、amHⅠ和NdeⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳分離后,割膠回收獲得帶有相同粘性末端的質(zhì)粒載體和目的基因,T4DNA連接酶16℃連接過夜;2.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化克隆菌株NEB10-β大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測序驗證;3.重組質(zhì)粒pMAL-c5X-hTERT-m、pMAL-c5X-hTERT-c轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株TB1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,挑取單個菌落進(jìn)行小培養(yǎng),0.3mmol/LIPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),經(jīng)12％SDS-PAGE初步驗證目的

3、蛋白是否表達(dá);4.重組表達(dá)菌TB1擴大培養(yǎng),0.3mmol/LIPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),運用直鏈淀粉樹脂層析柱和BioLogicDuoFlow蛋白純化儀分離提純目的蛋白,經(jīng)SDS-PAGE、Westernblot鑒定、考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度。5.利用間接ELISA法檢測135例癌癥患者、96例良性疾病患者及135例正常對照組血清抗hTERT-m和抗hTERT-c自身抗體的水平,檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：①成功構(gòu)

4、建pMAL-c5X-hTERT-m-TB1、pMAL-c5X-hTERT-c-TB1原核表達(dá)系統(tǒng),并能大量表達(dá)可溶性目的蛋白;②成功獲得高純度重組hTERT-m和hTERT-c蛋白,濃度分別為0.266mg/mL和1.0mg/mL;③間接ELISA法檢測血清抗hTERT-m和抗hTERT-c自身抗體結(jié)果發(fā)現(xiàn):正常對照組、良性疾病組和癌癥組血清抗hTERT-m自身抗體測定OD值(X±s)分別為0.302±0.063、0.421±0.093

5、和0.525±0.166,抗hTERT-c自身抗體測定OD值(X±s)分別為0.400±0.075、0.527±0.107和0.650±0.187;癌癥組高于良性疾病組和健康對照組(P<0.001),良性疾病組高于正常對照組(P<0.001);肺癌、大腸癌、乳腺癌和卵巢癌患者血清抗hTERT自身抗體水平高于相應(yīng)良性疾病患者血清,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：癌癥組患者血清抗hTERT-m和抗hTERT-c自身抗體水平顯著高于良性疾