他克莫司對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的實(shí)驗(yàn)性治療.pdf

1、目的：本研究應(yīng)用免疫抑制劑他克莫司（FK506，tacromulis）對(duì)多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型--實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis EAE）大鼠進(jìn)行治療，通過觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床表現(xiàn)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous sysyem，CNS）的病理改變、外周血T淋巴細(xì)胞CD3、CD4、CD8、NK細(xì)胞比率、神經(jīng)元生長(zhǎng)錐的主要磷酸蛋白成分生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（

2、Gap-43，Growth Associated Protein43）的表達(dá)，探討他克莫司對(duì)EAE的治療作用及其作用機(jī)制，并與傳統(tǒng)的治療方法潑尼松龍作為對(duì)比，為臨床治療多發(fā)性硬化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：（1）采用豚鼠全脊髓勻漿和完全福氏佐劑（complete freund's adjuvant，CFA）制成的混合液作為抗原，同時(shí)皮內(nèi)注射百日咳疫苗，復(fù)制多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型SD大鼠急性EAE。（2）將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組

3、（n=5）、EAE模型組（n=10）、FK506A組（n=10）、FK506B組（n=10）、潑尼松龍對(duì)照組（n=10）。自免疫后第10天起開始治療，F(xiàn)K506A組以他克莫司1mg/kg/d，F(xiàn)K506B組以他克莫司0.5m g/kg/d的劑量連續(xù)腹腔注射10天，潑尼松龍對(duì)照組10mg/kg/d的劑量連續(xù)腹腔注射10天，EAE組用同量生理鹽水代替。（3）免疫后每日觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重變化并進(jìn)行臨床評(píng)分；免疫后20天，采各組大鼠尾靜脈血ED

4、TA抗凝，用流式細(xì)胞儀法測(cè)T淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+8、和NK細(xì)胞比率變化；免疫后30天處死各組全部大鼠，做HE、Luxol Fast Blue-H.E.髓鞘染色、Bielschowsky軸突銀染色檢查觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理改變；GAP-43免疫組織化學(xué)染色觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生的形態(tài)學(xué)依據(jù)。 結(jié)果：（1）復(fù)制模型的大鼠出現(xiàn)臨床表現(xiàn)、病理改變均符合急性EAE的病變特點(diǎn)。（2）EAE對(duì)照組大鼠臨床癥狀高峰評(píng)分為（3.

5、02±0.98），體重減低最大值為（39.62±13.64）g，免疫后發(fā)病時(shí)間為（10.21±1.08）d，臨床病程持續(xù)（16.52±0.83）d。FK506A組大鼠臨床癥狀高峰評(píng)分為（1..21±0.31），體重減低最大值為（12.52±5.26）g，免疫后發(fā)病時(shí)間為（14.61±1.74）d，臨床病程持續(xù)（10.34±0.61）d。FK506B組大鼠臨床癥狀高峰評(píng)分為（1.52±0.36），體重減低最大值為（11.34±5.19）g

6、，免疫后發(fā)病時(shí)間為（14.08±1.39）d，臨床病程持續(xù)（10.91±1.21）d.，潑尼松龍對(duì)照組大鼠臨床高峰評(píng)分為（1.67±0.22），體重減低最大值為（-26.12±7.34），免疫后發(fā)病時(shí)間為（10.41±0.81）d，臨床病程持續(xù)（18.77±0.56）d。HE染色顯示，EAE組大鼠腦、小腦、脊髓的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分分別為（2.61±0.47）、（3.17±0.29）、（3.86±0.44），F(xiàn)K506A組大鼠腦、小腦、脊髓

7、的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分分別為（1.31±0.54）、（1.94±0.27）、（2.08±0.23），F(xiàn)K506B組大鼠腦、小腦、脊髓的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分分別為（1.27±0.69）、（1.87±0.35）、（2.12±0.76），潑尼松龍對(duì)照組大鼠腦、小腦、脊髓的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分分別為（1.12±0.41）、（2.31±0.14）、（2.29±0.58）。Luxol Fast Blue-H.E。髓鞘染色顯示，EAE組大鼠腦、小腦、脊髓的髓鞘脫

8、失評(píng)分分別為（1.59±0.83）、（2.07±0.74）、（2.21±0.51），F(xiàn)K506A組大鼠腦、小腦、脊髓的髓鞘脫失評(píng)分分別為（0.86±0.31）、（1.29±0.64）、（1.44±0.52）、FK506B組大鼠腦、小腦、脊髓的髓鞘脫失評(píng)分分別為（0.87±0.17）、（1.34±0.48）、（1.51±0.72），潑尼松龍對(duì)照組大鼠腦、小腦、脊髓的髓鞘脫失評(píng)分分別為（0.81±0.33）、（1.27±0.58）、（1.1

9、7±0.28）。Bielschowsky軸突銀染色顯示EAE組脊髓軸突損傷評(píng)分為（1.91±0.64）、FK506A組顯示脊髓軸突損傷評(píng)分（1.17±0.26）、FK506B組顯示脊髓軸突損傷評(píng)分（1.31±0.37），潑尼松龍對(duì)照組脊髓軸突損傷評(píng)分為（1.06±0.14）。EAE組、FK506A組、FK506B組、潑尼松龍對(duì)照組外周血CD3+T淋巴細(xì)胞比率分別為（67.22±1.21）、（58.17±0.96）、（60.28±2.13

10、）、（71.06±3.83）。EAE組、FK506A組、FK506B組、潑尼松龍對(duì)照組大鼠外周血CD4+T淋巴細(xì)胞比率分別為（51.27±2.13）、（41.34±1.41）、（44.12±2.69），（55.21±4.78）0 EAE組、FK506A組、FK506B組、潑尼松龍對(duì)照組大鼠外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比率分別為（28.16+1.53）、（14.43±0.74）、（13.2±1.17）、（26.34±1.72），EAE組、FK

11、506A組、FK506B組，潑尼松龍對(duì)照組大鼠外周血NK細(xì)胞比率分別為（8.52±1.16）、（1.07±0.41）、（1.89±0.21）、（7.62±0.49），EAE組CD4+/CD8+比值為（1.82±0.26），F(xiàn)K506A組CD4+/CD8+比值為（2.61±0.21），F(xiàn)K506B組CD4+/CD8+比值為（2.84±0.51），潑尼松龍對(duì)照組CD4+/CD8+比值為（2.09±0.38）。EAE組、FK506A組、FK5

12、06B組、潑尼松龍對(duì)照組大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GAP-43免疫組織化學(xué)染色中陽性細(xì)胞數(shù)分別為（195.96±21.51）、（454.52±17.63）、（397.19±19.09）、（211.61±12.51）。 結(jié)論：（1）本研究中復(fù)制的急性EAE模型成功、穩(wěn)定、可靠。（2）他克莫司對(duì)急性EAE有一定的治療作用，具有有效改善EAE的臨床表現(xiàn)，減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥損害、髓鞘脫失、和神經(jīng)軸突的損傷。（3）他克莫司治療組停藥后，未見臨