甘菊ClCBF家族基因分離及其對(duì)擬南芥的轉(zhuǎn)化.pdf

1、菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat)花朵艷麗，花期長(zhǎng)，品種繁多是中國(guó)傳統(tǒng)名花。但是低溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫限制其生長(zhǎng)和觀賞價(jià)值。因此培育綜合抗逆性強(qiáng)的菊花新品系對(duì)拓寬其應(yīng)用范圍、延長(zhǎng)觀賞時(shí)間、降低生產(chǎn)成本等具有重要意義。甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium（Fisch.ex Trautv.）Makino]是菊科菊屬的二倍體植物，遺傳背景簡(jiǎn)單，分布廣且具有較強(qiáng)的耐鹽堿能力。本

2、試驗(yàn)將從甘菊中分離在逆境條件下對(duì)提高植物抗逆性起到重要作用的CBF家族基因的同源基因，并對(duì)該基因進(jìn)行表達(dá)模式分析、生物信息學(xué)分析及轉(zhuǎn)入擬南芥以期對(duì)其功能進(jìn)行分析，以此來(lái)探討甘菊中CBF基因的表達(dá)模式與功能，以期能了解甘菊中CBF通路及為培育抗逆性強(qiáng)的菊花新品系提供基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.用NCBI網(wǎng)站上的BlastX程序?qū)φn題組前期構(gòu)建的甘菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中3個(gè)CBF(C-repeat Binding Factor)基因的

3、核苷酸序列進(jìn)行搜索比對(duì)，結(jié)果顯示，這3個(gè)基因都具AP2結(jié)構(gòu)域?qū)儆贏P2基因家族成員。通過(guò)對(duì)甘菊幼苗進(jìn)行鹽脅迫、低溫脅迫、高溫脅迫及ABA誘導(dǎo)處理，分析甘菊中ClCBF基因在不同脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明:ClCBF1受冷、熱、鹽脅迫的誘導(dǎo)，對(duì)鹽脅迫更加敏感;ClCBF2只受鹽的誘導(dǎo)表達(dá)，熱抑制其表達(dá);ClCBF4受到冷、鹽及ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，受冷誘導(dǎo)表達(dá)明顯。相同脅迫處理?xiàng)l件下，表達(dá)情況不同，預(yù)示3個(gè)基因的表達(dá)模式不同。
　　2.

4、通過(guò)3' RACE技術(shù)對(duì)ClCBF1和C1CBF4基因進(jìn)行全長(zhǎng)克隆。獲得ClCBF1基因核苷酸序列全長(zhǎng)為1149bp，含有633bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，獲得ClCBF4基因核苷酸序列全長(zhǎng)為823bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?42bp。通過(guò)對(duì)ClCBF的啟動(dòng)子元件分析發(fā)現(xiàn)，ClCBF1和ClCBF4這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子序列中都含有MYC、W-box、TATC等響應(yīng)元件。而在ClCBF4的啟動(dòng)子中檢測(cè)到了ABA響應(yīng)元件，在ClCBF1中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，這

5、與ClCBF4基因的表達(dá)情況相符合。
　　3.對(duì)克隆得到的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ClCBF1和ClCBF4具有CBF蛋白的特征序列，屬于CBF基因家族成員，而ClCBF2非該基因家族的成員。利用MEGA5軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中3個(gè)基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ClCBF1、ClCBF4處于DREB-A1分支上，而ClCBF2處于DREB-A4分枝上。
　　4.通過(guò)雙酶切的方法構(gòu)建pBI121-CBF的植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌侵染