禽傳染性支氣管炎病毒的檢測技術及其嗜腎型毒株雞胚傳代毒的致病性分析.pdf

1、傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis virus，IBV)是引起禽類傳染性支氣管炎的病原體，長期以來一直持續(xù)的給禽類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的威脅。疫苗的使用是預防該病的重要手段，快速準確的病原和抗體檢測診斷方法是臨床診斷與預防效果檢測的重要手段。為此，本論文開展了此項研究工作。
　　針對主要流行的呼吸型、腎型以及肌肉型4/91毒株，基于S1基因和nsp12基因片段設計出三對特異性引物，建立了IBV的RT-PCR分

2、型檢測方法。使用該引物進行PCR擴增，腎型IBV可以得到213bp和686bp的兩條帶，4/91型毒株可以得到213bp和261 bp的兩條帶，而呼吸型毒株只能得到213bp的一條帶，其它常見禽類病毒未擴增出相應片段。擴增產物經測序分析驗證為IBV特定的序列。使用該方法對呼吸型和腎型IBV毒株的cDNA最低檢出量為0.225 ng，肌肉型4/91型最低檢出量為2.25 ng。分型PCR方法對60份臨床組織樣品檢測結果與雞胚病毒分離結果完

3、全一致，表明本研究建立的RT-PCR分型檢測方法與病毒分離方法具有很好的吻合度。
　　以IBV H120為毒種，摸索了傳染性支氣管炎病毒血凝抗原的制備方法，結果顯示，血凝抗原的制備條件為超濾結合差速離心將IBV的抗原濃度濃縮至109.0EID50/0.1 mL，濃縮的IBV毒液用終濃度為2.5-3 U/mL的PLC1或50％的A型產氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清在37℃水浴3-4小時即可制備IBV血凝抗原。研究了血凝抑制試驗的待檢樣品處理方法

4、，證明，待檢血清在進行血凝抑制試驗之前必須用25％的酸化高嶺土處理90分鐘。分析了血凝抑制試驗的反應條件，證明，血凝抑制試驗的反應溫度為4℃，反應時間為45-60分鐘。滅活方法為0.1％的β-丙內酯于4℃處理抗原24h。人工免疫后的抗體水平檢測結果顯示該檢測方法相比于ELISA方法可以識別更早期的抗體。
　　IBV腎型毒株SC021202經SPF雞胚連續(xù)傳代獲得的F60代病毒液，以0.1mL、0.2 mL兩個劑量，借助滴鼻方式感染

5、1、7、21、60日齡的SPF雞，測定了IBV SC021202毒株雞胚適應60代毒的致病性。結果顯示:1日齡0.1mL組的死亡率為70％，0.2 mL組的死亡率為90％;7日齡的死亡率均為40％，而21、60日齡的雞感染后無明顯臨床癥狀。剖檢病死雞可見腎臟出現明顯的腫脹，內有白色尿酸鹽沉積，呈現典型的“花斑腎”樣病變。排毒動態(tài)檢測結果顯示，排毒時間為感染后4-10天。組織病料的病毒核酸檢測結果顯示，腎臟的檢出率高于氣管和肺臟。1、7日