家蠶滯育激素DH及其受體DHR1的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)研究.pdf

1、滯育是昆蟲為適應(yīng)不良環(huán)境而形成的一種在卵、幼蟲、蛹或成蟲期發(fā)育停滯的生理現(xiàn)象，對(duì)昆蟲生存和繁殖具有重要意義。鱗翅目模式昆蟲家蠶是卵滯育的典型代表，但其滯育的分子機(jī)制仍未徹底闡明。研究表明，家蠶咽下神經(jīng)節(jié)分泌的滯育激素（diapause hormone，DH）是誘導(dǎo)蠶卵滯育的主要因素，DH通過滯育激素受體（diapause hormone receptor，DHR）傳遞信號(hào)并最終決定卵的滯育。加強(qiáng)DH和DHR的功能及作用機(jī)制研究，有助加深

2、我們對(duì)家蠶卵滯育機(jī)制的了解，并為家蠶育種和卵滯育害蟲防控提供理論參考。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴從家蠶中鑒定并克隆了DH和DHR1基因的CDS序列。測(cè)序結(jié)果表明：DH基因CDS序列長(zhǎng)579 bp，編碼192個(gè)氨基酸，編碼蛋白含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；DHR1基因CDS序列全長(zhǎng)1311 bp，編碼436個(gè)氨基酸，含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。⑵構(gòu)建了用于過表達(dá)DH和DHR1基因的piggyBac表達(dá)載體pB[A4-GAL4,3×P3DsRed]、

3、pB[UASDH,3×P3EGFP]和pB[UASDHR1,3×P3EGFP]。將該3個(gè)載體質(zhì)粒顯微注射至Nis早期胚胎，通過熒光篩選獲得了相應(yīng)的G1代陽(yáng)性蛾圈，分別命名為A4G4、UASDH和UASDHR1。經(jīng)反向PCR和基因組PCR方法檢測(cè)確認(rèn)，3個(gè)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)基因系制作成功。⑶將A4G4轉(zhuǎn)基因系分別與UASDH和UASDHR1轉(zhuǎn)基因系雜交，通過對(duì)雜交后代個(gè)體進(jìn)行雙熒光篩選，獲得了過表達(dá)DH和DHR1的陽(yáng)性雜交后代，分別命名為A4G4/U

4、ASDH和A4G4/UASDHR1。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，DH和DHR1基因均顯著上調(diào)表達(dá)，表明轉(zhuǎn)基因過表達(dá)系制作成功。⑷利用qRT-PCR技術(shù)，首先對(duì)A4G4/UASDH個(gè)體中DH基因的時(shí)期表達(dá)特征進(jìn)行分析，結(jié)果表明：DH在蛹6天和9天各有一個(gè)表達(dá)高峰，其中蛹6天峰值最高，暗示蛹6天是DH決定家蠶卵滯育與否的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。隨后對(duì)DH下游的滯育相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：過表達(dá)DH對(duì)8個(gè)滯育相關(guān)基因的表達(dá)均有不同程度的影響，其中對(duì)

5、DHR1、TRE1、TRE2、OXR1、SDH1和SDH2ab的時(shí)期表達(dá)有明顯影響，對(duì)EA4和TRPA1的影響相對(duì)最小。對(duì)A4G4/UASDH的55個(gè)自交后代卵圈進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有7個(gè)卵圈出現(xiàn)了滯育。該結(jié)果表明，在多化性家蠶品系中過表達(dá)DH基因，能夠影響滯育相關(guān)基因的表達(dá)，但不足以使其后代蠶卵全部表現(xiàn)為滯育特性。⑸利用qRT-PCR技術(shù)，對(duì)A4G4/UASDHR1個(gè)體中DHR1基因的時(shí)期表達(dá)特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：DHR1在蛹6天和9天各

6、有一個(gè)表達(dá)高峰，其中蛹6天峰值最高，暗示蛹6天是DHR1參與決定家蠶卵滯育的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。進(jìn)一步對(duì)DHR1下游的滯育相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：過表達(dá)DHR1對(duì)7個(gè)滯育相關(guān)基因的表達(dá)均有不同程度的影響，其中對(duì)TRE1和TRE2的影響相對(duì)較大，發(fā)生表達(dá)變化的時(shí)期主要在蛹后期和蛾期；對(duì)OXR1、SDH1、SDH2ab、EA4和TRPA1的表達(dá)影響相對(duì)較小。對(duì)A4G4/UASDHR1的59個(gè)自交后代卵圈進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，所有卵圈均未出現(xiàn)滯育。該結(jié)