體外誘導(dǎo)兔骨髓基質(zhì)干細胞分化為成骨細胞的實驗研究.pdf

1、目的：通過密度梯度離心法分離兔骨髓基質(zhì)干細胞（Bone marrowstromal stem cells，BMSCs）行體外培養(yǎng)，探討B(tài)MSCs體外培養(yǎng)后的生物學(xué)特性，并誘導(dǎo)其向成骨細胞方向分化，觀察其成骨過程。方法：用2％戊巴比妥鈉以30mg/kg麻醉家兔后處死，分離雙側(cè)股骨、脛骨骨髓，利用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)分離純化兔BMSCs，制備單細胞懸液，接種于含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液中，通過傳代擴增，進一步去除未貼壁的細胞

2、，待細胞鋪滿瓶底近80％后，加入0.25％胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。取生長良好的對數(shù)期第3代細胞，以1×107/L的細胞濃度接種于預(yù)置蓋玻片的24孔培養(yǎng)板內(nèi)。實驗細胞分為2組：實驗組使用成骨細胞誘導(dǎo)液，定向誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞分化；對照組等量加入含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。兩組細胞持續(xù)培養(yǎng)，進行細胞成骨分化觀察。主要觀察指標：在倒置顯微鏡下觀察細胞生長及增殖情況，流式細胞儀檢測細胞表面標志物的表達，透射電鏡觀察細胞

3、的超微結(jié)構(gòu)，Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色，VON KOSSA染色和堿性磷酸酶染色檢測向成骨細胞誘導(dǎo)分化情況，并作統(tǒng)計分析。結(jié)果：用兔淋巴細胞分離液梯度離心結(jié)合貼壁法從骨髓中分離單個核細胞，接種于含10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液。在接種后48小時貼壁，細胞形態(tài)為橢圓形，多角形及短梭形；72小時后出現(xiàn)散在的紡錘狀貼壁細胞；10-14天后形成克隆。BMSCs貼壁稀疏時，長梭形細胞的兩極朝向不規(guī)則，細胞排列紊亂，細胞之間往往通過突起相連接，約3

4、周出現(xiàn)致密的貼壁細胞層，此時細胞的兩極開始有規(guī)律的排列成束狀，有的呈漩渦狀。經(jīng)傳代擴增，細胞進一步純化，細胞形態(tài)為均一的長梭形并呈漩渦狀排列，而且生長速率加快，P1代細胞群體倍增時間約為37小時。P3代細胞生長潛伏期為3-4天，第4-6天進入對數(shù)生長期，2周后進入平臺期。流式細胞儀檢測CD34，CD45陰性，CD44陽性。電鏡顯示BMSCs胞核呈類圓形或不規(guī)則型，核膜清晰，有1-2個核，染色質(zhì)較粗，胞質(zhì)中細胞器豐富，細胞表面有絨毛。用成

5、骨細胞誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo)第3代BMSCs第7天，可觀察到少許細胞由梭形變?yōu)槎嘟切巍ｋS著時間的增長，多角形的細胞逐漸增多并聚集成團，14天后Von Kossa染色出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶染色呈陽性。對照組未見鈣化結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶染色呈陰性。經(jīng)誘導(dǎo)后的細胞堿性磷酸酶染色明顯，胞質(zhì)中陽性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀沉淀，堿性磷酸酶活性部位呈棕黑色。Vonkossa染色可見黑色的礦化結(jié)節(jié)顆粒，顆粒大小不均一，提示有礦化基質(zhì)沉積。骨誘導(dǎo)培養(yǎng)三周，免疫組化S

6、P法可檢測到Ⅰ型膠原表達，在結(jié)節(jié)周圍呈黃褐色，而對照組則未能表達。結(jié)論：（1）將兔骨髓基質(zhì)干細胞進行體外培養(yǎng)，能夠在較短的時間內(nèi)獲得大量較高純度的干細胞，且周期短，重復(fù)性好，可作為組織工程學(xué)中種子細胞的重要來源。（2）地塞米松在骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化過程中所誘導(dǎo)的實驗組在細胞在形態(tài)和生物學(xué)特性上都較對照組更具有成骨細胞的特征，其ALP得活性和形成鈣結(jié)節(jié)的能力都強于對照組細胞。（3）BMSCs在體外適合的條標件下可以向成骨細胞轉(zhuǎn)化，并