DNA電化學(xué)生物傳感器的設(shè)計(jì).pdf

1、隨著人類基因組計(jì)劃(HGP)的實(shí)施，基因診斷已經(jīng)成為分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中的重要領(lǐng)域。人體、病毒和細(xì)菌核酸中特定堿基序列的檢測(cè)在疾病診斷、食品污染、法醫(yī)鑒定和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域都將會(huì)發(fā)揮越來越重要的作用。大規(guī)模的基因檢測(cè)要求建立更簡(jiǎn)便、迅速、廉價(jià)、微型化的分析裝置。許多新的生物技術(shù)的開發(fā)，為發(fā)展高靈敏度、高特異性的基因分析檢測(cè)方法注入了活力，其中利用DNA雙鏈的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則發(fā)展起來的各種DNA生物傳感技術(shù)，受到生物分析工作者的高度重

2、視。電化學(xué)DNA生物傳感器以其靈敏度高、輕巧便宜、攜帶方便、耗能少、能與現(xiàn)代微電子技術(shù)聯(lián)用，易于實(shí)現(xiàn)微型化等優(yōu)點(diǎn)，受到了研究者們的廣泛關(guān)注，儼然成為當(dāng)今生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿性課題。 法拉第交流阻抗技術(shù)是研究電極過程的有效工具，被廣泛的應(yīng)用于電化學(xué)研究領(lǐng)域，可以得到比其他電化學(xué)方法更多的動(dòng)力學(xué)信息及電極界面結(jié)構(gòu)的信息，例如，電子傳遞電阻、雙電層電容等。用該技術(shù)構(gòu)建的電化學(xué)DNA生物傳感器，可以檢測(cè)雜交前后電極表面電化學(xué)性質(zhì)的變化

3、，具有靈敏、迅速、非標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)。 近兩年，隨著人類基因組計(jì)劃的完成和功能基因?qū)W、蛋白組學(xué)研究的開展，發(fā)展能對(duì)重要蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)跟蹤的高靈敏度的分析方法是后基因組時(shí)期一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。傳統(tǒng)蛋白質(zhì)的檢測(cè)主要利用抗體-抗原的特異相互作用。核酸識(shí)體對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合力和特異性可與蛋白質(zhì)的抗原抗體間的作用力相媲美，且比抗體有許多優(yōu)越性。例如：核酸識(shí)體是人工化學(xué)合成，合成簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，而且可以按需要對(duì)序列中的核苷酸定點(diǎn)修飾各種官

4、能團(tuán)(如熒光基團(tuán)等)，便于核酸識(shí)體的固定化和信號(hào)的檢測(cè)，與蛋白質(zhì)作用的動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以按要求改變等。因此人們利用核酸適體構(gòu)建蛋白質(zhì)生物傳感器已引起許多科學(xué)工作者的關(guān)注。 本論文有機(jī)結(jié)合了核酸分子的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則、法拉第交流阻抗技術(shù)以及核酸適體對(duì)蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別能力，設(shè)計(jì)了幾種新型的電化學(xué)DNA生物傳感器，不僅能快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測(cè)特定序列的DNA片段，還能識(shí)別對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)分子，拓寬了后基因時(shí)代的研究領(lǐng)域 論文分為五章

5、：第一章：緒論首先系統(tǒng)介紹了DNA生物傳感器的基本結(jié)構(gòu)和分類。著重介紹了DNA電化學(xué)生物傳感器的設(shè)計(jì)，如DNA片段的固定方法、DNA雜交及雜交信號(hào)的轉(zhuǎn)化兩方面。接著介紹了交流阻抗技術(shù)的基本原理，及在DNA生物傳感器方面的應(yīng)用和研究進(jìn)展。最后介紹了核酸適體的概念及應(yīng)用、研究現(xiàn)狀。 第二章：基于硫堇—碳納米管修飾電極的電化學(xué)DNA生物傳感器本章介紹了一種基于硫堇-碳納米管修飾的玻碳電極構(gòu)建的DNA生物傳感器，檢測(cè)痕量的目標(biāo)DNA。利

6、用硫堇(TH)和羧基化的多壁碳納米管之間的π-π堆積作用將硫堇連接到碳納米管上，固定、雜交。然后用差分脈沖伏安法(DPV)檢測(cè)道諾酶素和修飾電極表面的雙鏈DNA(dsDNA)發(fā)生相互作用時(shí)所產(chǎn)生的電信號(hào)。電極表面修飾的硫堇-碳納米管，一方面可以顯著增加DNA的固定量，另一方面可以增強(qiáng)電極表面的電子傳遞能力。因此該硫堇-碳納米管修飾電極相比于其它電極可以獲得更低的檢測(cè)限，達(dá)到3.0×10-13M。 第三章基于交流阻抗技術(shù)構(gòu)建的DN

7、A生物傳感器本章設(shè)計(jì)了一種基于交流阻抗技術(shù)構(gòu)建的DNA生物傳感器直接監(jiān)測(cè)DNA雜交的方法。將5’端巰基修飾的24個(gè)堿基的寡聚核苷酸DNA(SH-ssDNA)和巰基乙酸(SH-CH2COOH)同時(shí)自組裝到金電極表面，形成雜交識(shí)別層，用循環(huán)伏安法和法拉第交流阻抗技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，取雜交前后信號(hào)的改變值作為雜交信號(hào)。實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化了各項(xiàng)條件，如雜交識(shí)別層的固定時(shí)間、雜交識(shí)別層中SH-ssDNA和SH-CH2COOH的比例、雜交溫度和時(shí)間等。在優(yōu)化的實(shí)

8、驗(yàn)條件下，此DNA生物傳感器能達(dá)得到3.0×10-14M的檢測(cè)下限；單堿基錯(cuò)配和三堿基錯(cuò)配的信號(hào)值分別為完全互補(bǔ)序列的55.6％和1.3％。 第四章基于硫堇電荷中和作用的電化學(xué)阻抗DNA雜交傳感器本章介紹了一種運(yùn)用硫堇電荷中和作用構(gòu)建的交流阻抗DNA雜交傳感器。將5’端修飾有巰基的單鏈發(fā)卡DNA探針與巰基乙酸同時(shí)自組裝到金電極表面，形成DNA分子識(shí)別層。然后將硫堇分子嵌入到雜交后的雙鏈DNA分子中，利用硫堇對(duì)雙鏈DNA的電荷中和

9、作用使修飾電極的表面電子傳遞電阻(Ret)減小。實(shí)驗(yàn)中選擇發(fā)卡DNA探針修飾電極和硫堇嵌入后的雙鏈DNA修飾電極的Ret差值作為雜交信號(hào)，以基于發(fā)卡DNA探針的特殊結(jié)構(gòu)和硫堇的嵌入法擴(kuò)增雜交信號(hào)，該DNA雜交傳感器具有較好的檢測(cè)靈敏度和選擇性。在雜交溫度優(yōu)化條件下，此DNA傳感器的對(duì)完全互補(bǔ)鏈的檢測(cè)下限為5.0×10-13M，一個(gè)堿基錯(cuò)配序列的雜交信號(hào)是完全互補(bǔ)序列信號(hào)的38.9％。 第五章基于交流阻抗技術(shù)和DNA適體構(gòu)建的蛋白