海參腸道產(chǎn)蛋白酶菌的分離鑒定及酶學(xué)特性研究.pdf

1、Q i n g d a o A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t yT h e T h e s i s o f P r o f e s s i o n a lM a s t e rI s o l a t i o na n d I d e n t i f i c a t i o no f P r o t e a s e —P r o d u c i n gB a c t ，e r i af r

2、 o m t h e t r a c to f s e a c u c u m b e r a n d I t sE n z y m a t i c P r o p e r t i e sG r a d u a t e w i t h P r o f e s s i o n a lM a s t e r D e g r e e ：F o o d E n g i n e e r i n gM e n t o r ：P i a oM e i

3、 z iS e c o n d M e n t o r ：L u a n H o n g j i eT y p e o f P r o f e s s i o n a lD e g r e e ：M a s t e r o f E n g i n e e r i n gA c a d e m i c f i e l d ：F o o d E n g i n e e r i n gQ i n g d a o ．C h i n aJ u n

4、 e ，2 0 1 4青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 摘要海參腸道產(chǎn)蛋白酶菌的分離鑒定及酶學(xué)特性研究摘要采用水解透明圈和蛋白酶活力測(cè)定的方法，從海參腸道中分離出一株具有產(chǎn)蛋白酶能力的菌株。對(duì)該茵株進(jìn)行了形態(tài)觀察、生理生化鑒定和1 6 S r D N A 全序列鑒定。研究了菌株產(chǎn)蛋白酶的最適發(fā)酵條件，考察了碳源、氮源、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、起始p H值、裝樣量等因素對(duì)茵株產(chǎn)蛋白酶的影響。同時(shí)利用硫酸銨沉淀、聚乙二醇濃縮、D E A ES e p

5、h a d e xA ．5 0 陰離子交換層析等方法分離純化出一種電泳級(jí)純蛋白酶，并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究?？疾炝说鞍酌傅姆肿恿?、最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)p H 值、p H 值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性、金屬離子及抑制劑對(duì)酶活力的影響、酶促動(dòng)力學(xué)等性質(zhì)。結(jié)果顯示：1 ．經(jīng)分離獲得一株具有產(chǎn)蛋白酶能力的菌株，屬于革蘭氏陽(yáng)性茵，桿狀，兩端鈍圓。菌落形態(tài)特征為表面濕潤(rùn)，圖形，不透明，邊緣光滑，易挑取，顏色呈乳白色，，菌落。生理生化鑒定結(jié)果顯示：具有水解淀

6、粉能力，能利用杲糖和明膠，耐1 5 ％N a C l ，甲基紅和V P ．實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性。進(jìn)一步的1 6 Sr D N A 全序列分析表明：該茵株屬于細(xì)茵，厚壁茵門，桿菌綱，茅孢桿菌目，芽孢桿菌科，茅孢桿菌屬，與B a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n ss t r a i nM L 4 5 6 有9 9 ．0 ％同源性，將其命名為B a c i l l u ss p ．H S 。2 ．B

7、 a c i l l u ss p ．H S 菌株的生長(zhǎng)曲線圖表明：菌株在培養(yǎng)時(shí)間達(dá)4 ．1 0h 時(shí)為生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期。該時(shí)期的發(fā)酵液較適合作為液體發(fā)酵的種子液。采用單因素分析法研究了環(huán)境因素對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶力的影響。結(jié)果顯示：菌株產(chǎn)蛋白酶的最適條件是0 ．5 ％可溶性淀粉、O ．5 ％脫脂黃豆粉，裝樣量為2 0 ％，培養(yǎng)基初始p H 值自然，培養(yǎng)溫度2 5 ℃，培養(yǎng)時(shí)間6 0 h ，接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶沒(méi)有顯著的影響。經(jīng)過(guò)條件優(yōu)化的發(fā)酵液蛋白

8、酶活力可達(dá)到1 7 0U ／m L 。3 ．分離純化得到電泳級(jí)純蛋白酶，該酶分子量為7 4 ．1k D a ，最適反應(yīng)溫度為6 0 ℃，屬高溫酶，最適反應(yīng)p H 值為1 0 ．0 ，為堿性蛋白酶，且在5 0 ℃下熱穩(wěn)定性較好。動(dòng)力學(xué)常數(shù)K m 為6 ．2m g ／m L 。F e ”和C u 2 + 對(duì)其有很強(qiáng)的抑制作用，E D T A 對(duì)蛋白酶抑制率為1 0 ％，而P M S F 對(duì)蛋白酶的抑制率高達(dá)9 0 ％，說(shuō)明該酶的活性中心可能