垂體腺瘤細胞培養(yǎng)及替莫唑胺治療難治性垂體腺瘤的實驗研究.pdf

1、垂體腺瘤(pituitary adenoma)是最多發(fā)的顱內(nèi)腫瘤之一,其解剖檢出率為25％。該腫瘤的生物學性狀及臨床表現(xiàn)存在較大個體差異。部分垂體腺瘤生長緩慢,無明顯臨床癥狀,只在體檢時被發(fā)現(xiàn),無需特殊治療。而另有部分垂體腺瘤,常規(guī)手術(shù)、放療及垂體藥物(例如,多巴胺受體激動劑及生長抑素類似物)均難以將其治愈,病變反復發(fā)作、持續(xù)進展,少部分出現(xiàn)腫瘤組織的遠位轉(zhuǎn)移,即垂體腺癌,其發(fā)病率為0.2％。在篩選難治性垂體腺瘤替代治療措施的過程中,替

2、莫唑胺(temozolomide,TMZ)己被部分臨床試驗報道療效確切。但另有部分報道未發(fā)現(xiàn)TMZ對該類腫瘤發(fā)揮穩(wěn)定療效,其對垂體腺瘤抑制作用的分子機制仍不明確。本實驗研究以垂體腺瘤原代細胞及細胞系為平臺,探討TMZ對垂體腺瘤的效用及相關(guān)分子生物學機制,并報道一例不典型垂體腺瘤的替莫唑胺臨床治療情況。
　　 第一部分垂體腺瘤細胞的體外培養(yǎng)
　　 目的:分析影響垂體腺瘤細胞體外生存的因素,探討適于垂體腺瘤細胞維持生物學性狀

3、的體外培養(yǎng)方案,改良人垂體腺瘤細胞體外生存條件,為臨床及基礎(chǔ)實驗研究提供可靠的體外實驗平臺。
　　 方法:取無功能垂體腺瘤手術(shù)標本33例,行體外分離、接種及培養(yǎng)。并就細胞的體外生存時間行生存相關(guān)因素分析。腫瘤細胞接種于Laminin、Matrigel、PPL、Collagen及普通培養(yǎng)板界面,觀察各細胞培養(yǎng)界面對垂體腫瘤細胞活力的影響。
　　 結(jié)果:Kaplan Meier生存分析發(fā)現(xiàn)細胞體外存活時間與患者年齡、性別、腫

4、瘤類型、腫瘤是否復發(fā)、腫瘤侵襲與否、術(shù)前是否接受過放療及Ki-67 LI水平等均沒有明顯相關(guān)(P>0.05)。二維及三維培養(yǎng)界面無功能垂體腺瘤原代細胞活力對比分析顯示,Matrigel、Laminin、Collagen組細胞活力明顯大于細胞培養(yǎng)板裸面培養(yǎng)的細胞(Matrigel、Laminin組vs.NC,P<0.01；Collagen組vs.NC,P<0.001)。而Lysine組與對照組相比沒有明顯差異(P>0.05)。Matrig

5、el及Laminin組細胞活力大于其它各培養(yǎng)界面的細胞(P<0.001,vs.Lysine； P<0.01 vs.Collagen)。collagen組細胞活力則高于Lysine組(P<0.05)。Matrigel與Laminin組細胞活力沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。因此,各細胞培養(yǎng)界面的無功能垂體腺瘤細胞活力大小排序為:Matrigel、Lanlinin組>Collagen組>Lysine及普通培養(yǎng)板裸面組。
　　 結(jié)論:

6、體外培養(yǎng)的無功能垂體腺瘤細胞生長緩慢。其體外生存時間與患者年齡、性別、腫瘤類型、腫瘤是否復發(fā)、腫瘤侵襲與否、術(shù)前是否接受過放療及Ki-67 LI水平等均沒有明顯相關(guān)。Laminin及Matrigel培養(yǎng)界面可以較PPL及Collagen三維培養(yǎng)界面更好地提升垂體腺瘤細胞的活力,可為垂體腺瘤體外實驗研究提供活力更接近在體環(huán)境的細胞平臺。
　　 第二部分替莫唑胺對促性腺激素垂體腺瘤細胞的效用及機制
　　 目的:常規(guī)手術(shù)、化療

7、及放療多難以治愈侵襲性垂體腺瘤,新的替代療法亟待研發(fā)。臨床已嘗試將替莫唑胺擴大適應癥用于治療侵襲性垂體腺瘤,但臨床療效報道存在分歧。本實驗首次研究替莫唑胺對促性腺激素腺瘤細胞活力及激素分泌的抑制效果及可能機制。
　　 方法:梯度濃度的替莫唑胺(31.25-1000μM)或溶劑對照孵育αT3-1細胞0-72 h后,CCK-8法檢測細胞活力,并依據(jù)細胞生長抑制曲線獲得IC50值。收集IC50濃度替莫唑胺處理的細胞樣本行流式細胞技術(shù)、

8、TUNEL染色及投射電子顯微鏡檢測,對細胞周期改變及凋亡程度進行統(tǒng)計學分析。使用Caspase-Glo(R)試劑盒檢測腫瘤細胞caspase-3/7,-8及-9的活性改變。Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及PARP的表達情況。Centaur(R)XP免疫測定系統(tǒng)檢測細胞培養(yǎng)基上清促性腺激素水平變化。
　　 結(jié)果:替莫唑胺劑量及時間依賴性抑制αT3-1細胞活力(P<0.01 vs.control,250

9、μM,24 h)并導致腫瘤細胞周期S期延長及G2/M期阻滯(P<0.05 vs.control,250μM,24 h)。替莫唑胺孵育24 h可明顯誘發(fā)早期細胞凋亡(P<0.001 vs.control,250μM),透射電鏡及TUNEL染色發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞核團縮、染色質(zhì)濃聚等細胞凋亡形態(tài)學改變。替莫唑胺(250μM)孵育24 h將αT3-1細胞caspase-3/7的活性提升了6倍,caspase-9活性提升了7倍,caspase-8活性提

10、升了3倍,且顯著負調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(P<0.001 vs.control)并促進PARP的蛋白裂解。細胞培養(yǎng)基上清的FSH及LH水平在替莫唑胺孵育后明顯下降(P<0.01 vs.control,250μM,24 h)。
　　 結(jié)論:替莫唑胺穩(wěn)定抑制促性腺激素腺瘤細胞活力并下調(diào)促性腺激素水平,誘導垂體腫瘤細胞周期阻滯,且通過調(diào)控死亡受體及線粒體凋亡信號通路促進腫瘤細胞凋亡。替莫唑胺可能成為侵襲性垂體腺瘤的可靠替代療法。

11、
　　 第三部分替莫唑胺對人原代垂體腺瘤細胞的藥效及其與腫瘤MGMT表達水平的相關(guān)性分析
　　 目的:觀察替莫唑胺對人原代垂體腺瘤細胞的藥效,并檢驗MGMT表達水平對腫瘤TMZ敏感性指示作用的準確度。
　　 方法:取垂體腺瘤手術(shù)標本26例,行體外分離、接種及培養(yǎng)。原代細胞平臺上行TMZ藥物敏感試驗,計算每株細胞的TMZ IC50數(shù)值。免疫組化法檢測細胞來源腫瘤的MGMT表達水平,并將其與細胞的TMZ IC50數(shù)值

12、進行Spearman相關(guān)分析。結(jié)果:TMZ處理的26例原代垂體腺瘤細胞中,24例(92.31％,2例無功能垂體腺瘤除外)表現(xiàn)TMZ劑量依賴性活力抑制；9例(34.62％,3例GH腺瘤,6例無功能垂體腺瘤)出現(xiàn)小于最大給藥濃度的IC50值。細胞來源患者的垂體腺瘤組織MGMT免疫組織化學染色結(jié)果顯示,9例(34.62％,4例GH腺瘤,1例泌乳素腺瘤,4例無功能垂體腺瘤)為低表達,MGMT表達比率小于10％；14例(53.85％,12例無功能

13、垂體腺瘤,2例生長激素腺瘤)為中度表達,MGMT表達比率大于10％但小于50％；3例(11.54％,均為無功能垂體腺瘤)為高表達,MGMT表達比率大于50％。對26例垂體腺瘤TMZ IC50數(shù)據(jù)集及MGMT表達比率值的Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示,二者的相關(guān)系數(shù)為-0.094,P>0.05,即TMZ IC50及MGMT表達比率之間沒有明顯相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論:TMZ能夠?qū)s30％-40％的垂體腺瘤發(fā)揮穩(wěn)定抑瘤作用。TMZ

14、對垂體腺瘤細胞的IC50及腫瘤MGMT表達比率之間不存在明顯相關(guān)關(guān)系,提示MGMT不能精確地指示垂體腺瘤對TMZ的敏感性。TMZ的在體療效仍有待臨床研究進一步闡明。
　　 第四部分替莫唑胺治療難治性垂體腺瘤一例
　　 目的:探討難治性垂體腺瘤的有效替代治療方法。
　　 方法:采用手術(shù)、伽馬刀及再次手術(shù)治療一例難治性垂體腺瘤患者。根據(jù)其原代腫瘤細胞的TMZ藥敏試驗結(jié)果,選用TMZ治療兩個療程,總結(jié)分析其療效。

15、>　　 結(jié)果:由于腫瘤生長迅速,常規(guī)手術(shù)、放療及藥物治療均難以控制難治性垂體腺瘤的生長及病情進展。腫瘤組織病理檢測結(jié)果提示,Ki-67 LI約40％-50％,MGMT表達屬低水平。TMZ對該患者原代腫瘤細胞的IC50小于最大給藥濃度,提示腫瘤細胞對TMZ敏感?；颊叻锰婺虬穬蓚€療程,腫瘤停止快速生長,MRI示腫瘤出現(xiàn)液化壞死。
　　 結(jié)論:對于常規(guī)手術(shù)、放療及藥物治療無效的難治性垂體腺瘤,替莫唑胺化療可能是一種有效替代治療方