大豆異黃酮代謝途徑在大腸桿菌中的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、大豆異黃酮(Soybean Isoflavones，SiF)具有多重保健與藥理作用，是近年來(lái)各相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。從大豆中分離提取異黃酮一直是大豆異黃酮的主要獲得途徑。作為植物天然次生代謝物，大豆異黃酮在大豆中含量并不高，且植物生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，因此只靠從大豆中提取異黃酮比較有限。隨著大豆基因組研究和現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷進(jìn)展，使利用基因工程手段構(gòu)建工程菌發(fā)酵生產(chǎn)大豆異黃酮成為可能，為尋找大豆異黃酮新的來(lái)源開(kāi)拓了新的方法和思路，具有重要意義。

2、 本文以經(jīng)過(guò)紫外線誘導(dǎo)的大豆葉片為材料，利用SMART(Switching Mechanism At 5′end of theRNA Tanscript)思想和方法構(gòu)建大豆葉片全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，并直接以一級(jí)庫(kù)液稀釋液為模板進(jìn)行PCR，快速克隆得到異黃酮代謝途徑相關(guān)的6個(gè)全長(zhǎng)基因，測(cè)序結(jié)果表明各基因序列都是正確的。 將基因與pET質(zhì)粒連接構(gòu)建了各個(gè)單基因表達(dá)載體，在大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)

3、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，除c4h基因外都得到了特異性表達(dá)蛋白。對(duì)CHS進(jìn)行質(zhì)譜定性分析表明，在p<0.05水平上，蛋白匹配分值為84，證明所表達(dá)的特異性蛋白是大豆查爾酮合成酶(CHS)。 在各個(gè)單基因表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了多基因表達(dá)載體，使除c4h外的5個(gè)基因由兩個(gè)載體攜帶導(dǎo)入到E.coli BL21(DE3)中，各基因前都帶有相應(yīng)的T7啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(Ribosome Bind Site,RBS)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

4、明，在一定條件下攜帶多基因的雙質(zhì)粒穩(wěn)定共存的時(shí)間較長(zhǎng)，足夠進(jìn)行代謝及發(fā)酵研究。重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，以酪氨酸為底物進(jìn)行發(fā)酵研究，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過(guò)HPLC測(cè)定，結(jié)果表明和空白對(duì)照相比有新的代謝產(chǎn)物生成，初步斷定為異黃酮類(lèi)化合物：利用二級(jí)質(zhì)譜分析重組菌株代謝產(chǎn)物，證明其中有大豆異黃酮的代謝產(chǎn)物雌馬酚。進(jìn)一步鑒定實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行中。 本文采用基因工程手段，將完整的大豆異黃酮代謝途徑在大腸桿菌進(jìn)行了構(gòu)建，并進(jìn)行了發(fā)酵和表達(dá)研究，得到了可以代謝