慢性乙型肝炎患者HBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞增殖老化研究.pdf

1、慢性乙型肝炎(chronichepatitisB，CHB)危害嚴(yán)重，是肝癌、肝硬化的首要病因。2005年，慢性乙型肝炎被列為我國(guó)四大重點(diǎn)防治的傳染病之一。明確乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)持續(xù)感染的免疫病理機(jī)制，對(duì)慢性乙型肝炎的防治至關(guān)重要。HBV特異性CD8+T細(xì)胞，即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicTlymphocytes，CTLs)介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在病毒清除過(guò)程中起主導(dǎo)作用；HBV特異性CTLs功能低下

2、是慢性乙型肝炎病毒持續(xù)感染的關(guān)鍵原因。探討HBV特異性CTLs功能低下的機(jī)制是研究的焦點(diǎn)。 在慢性乙型肝炎研究中發(fā)現(xiàn)，患者的HBV特異性CTLs在體外給予抗原肽刺激后不能增殖或增殖能力下降；而急性自限性乙型肝炎患者以及恢復(fù)期患者的HBV特異性CTLs在體外給予抗原肽刺激后可以迅速增殖，分泌細(xì)胞因子并行使其效應(yīng)功能?？寺U(kuò)增是淋巴細(xì)胞最基本的功能，抗原特異性CTLs增殖的同時(shí)獲得效應(yīng)功能,CTLs的增殖能力是病原體能否清除的關(guān)鍵。

3、因此慢性乙型肝炎患者HBV特異性CTLs增殖能力下降是其功能低下的關(guān)鍵。然而，慢性乙型肝炎患者HBV特異性CTLs不能增殖或增殖能力下降的原因并沒(méi)有進(jìn)一步的研究報(bào)道。 T細(xì)胞增殖老化(replicativesenescence)是指細(xì)胞有新陳代謝，但是增殖能力下降或不能進(jìn)一步增殖。老化T細(xì)胞的首要特點(diǎn)是：細(xì)胞增殖能力下降、CD28表達(dá)缺失。老化T細(xì)胞還具有以下重要特點(diǎn)：(1)細(xì)胞表面表達(dá)自然殺傷細(xì)胞相關(guān)受體(naturalkil

4、ler-associatedreceptors，NKRs)，如CD56、CD57、殺傷細(xì)胞抑制性受體(killerinhibitoryreceptor，KIR)；(2)細(xì)胞對(duì)凋亡耐受；(3)細(xì)胞多處于分化晚期或終末期；(4)老化T細(xì)胞效應(yīng)功能低下。T細(xì)胞增殖老化是正常人體老化的一部分，是老年人免疫功能低下的重要原因。 然而T細(xì)胞增殖老化的過(guò)程與年齡無(wú)關(guān)，因?yàn)樗歉鶕?jù)T細(xì)胞增殖歷史而不是人的壽命命名的。研究表明抗原持續(xù)存在引起的免

5、疫活化，迅速導(dǎo)致病毒特異性CTLs老化。在年輕的慢性炎癥、持續(xù)感染患者體內(nèi)能夠發(fā)現(xiàn)老化的T細(xì)胞，與患者的年齡不相符，并且這群細(xì)胞與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，它們的存在和意義正引起人們的關(guān)注。在持續(xù)HIV感染患者及持續(xù)的巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染患者發(fā)現(xiàn)，病毒特異性CTL增殖能力下降，細(xì)胞效應(yīng)功能低下，并且CTLs不表達(dá)CD28、耐受凋亡，與增殖老化的T細(xì)胞相同。增殖老化的病毒特異性CTLs功能低下，是病毒持續(xù)

6、感染不能得到有效控制的原因。 基于上述研究結(jié)果，我們推測(cè)慢性乙型肝炎患者HBV特異性CTLs功能低下是由于CTLs處于增殖老化狀態(tài)。本研究擬利用肽-MHC-Ⅰ類分子五聚體(pentamer)技術(shù)、胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(intracellularcytokinestaining，ICCS)技術(shù)和多色流式分析技術(shù)，根據(jù)老化T細(xì)胞的特點(diǎn)，直接離體情況下(directlyexvivo)進(jìn)行以下研究：1.檢測(cè)慢性乙型肝炎患者不同HBV特異性C

7、TLs表面標(biāo)志CD27、CD28、CD45RA、CD45RO的表達(dá)，以明確HBV特異性CTLs的CD28表達(dá)情況和細(xì)胞分化狀態(tài)；2.檢測(cè)CD56、CD57、KIR表達(dá)以了解NKRs在HBV特異性CTLs的表達(dá)情況；3.檢測(cè)Bcl-2和Ki-67的表達(dá)了解細(xì)胞的增殖和凋亡情況；4.檢測(cè)perforin、granzymeB和IFN-γ的表達(dá)明確細(xì)胞的功能狀態(tài)。通過(guò)四部分的研究以證實(shí)慢性乙型肝炎患者HBV特異性CTLs處于增殖老化狀態(tài)。結(jié)果如

8、下： 首先，我們選取三個(gè)在急性感染時(shí)具有代表性的優(yōu)勢(shì)性表位，即針對(duì)HBV核心抗原core18-27，被膜抗原env335-343以及聚合酶抗原pol575-583的pentamer，檢測(cè)了慢性乙型肝炎患者外周血中三個(gè)表位特異性CTLs的頻率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在病毒載量＜107copies/ml的患者，能夠檢測(cè)出HBcAg(18-27)特異性CTL，HBeAg(335-343)特異性CTL及HBp(575-583)特異性CTL；在病毒載

9、量＞107copies/ml的患者，能夠檢測(cè)出HBeAg(335-343)特異性CTL及HBp(575-583)特異性CTL。這與我們工作小組既往的研究報(bào)道相同。結(jié)果提示慢性乙型肝炎患者體內(nèi)HBV特異性CTLs并沒(méi)有被克隆清除。 在這部分研究的結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)兩例患者所感染的HBV，其HBVDNA編碼的HBcAg(18-27)表位為FLPSDFFPSI，第27位氨基酸為Ⅰ；而在這兩例患者體內(nèi)檢測(cè)出針對(duì)HBcAg(18-27FLP

10、SDFFPSV)特異性的CTL。推測(cè)患者最初是野生型HBV感染，最終在肝臟被清除，而負(fù)性篩選的變異株逐漸在肝組織中占有優(yōu)勢(shì)；但是肝外組織中的野生型HBV可以存活下來(lái)，并釋放病毒顆粒感染肝臟，以維持CTL的應(yīng)答；并且在這個(gè)研究中，變異僅發(fā)生在這個(gè)表位。另一個(gè)解釋是由于交叉遞呈機(jī)制，識(shí)別HBcAg(18-27FLPSDFFPSI)特異性的CTL也可以識(shí)別表位HBcAg(18-27FLPSDFFPSV)。 其次，我們利用流式細(xì)胞儀多色

11、熒光標(biāo)記的方法對(duì)慢性乙型肝炎患者的HBV特異性CTLs進(jìn)行表型分析。三色熒光分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)50％以上的HBcAg(18-27)及HBeAg(335-343)特異性CTL不表達(dá)CD28，提示HBV特異性CTL暴露在抗原刺激下，重復(fù)多輪增殖后，CD28表達(dá)逐漸丟失。另外我們發(fā)現(xiàn)50％左右的HBpAg(575-583)表位特異性的CTL表達(dá)CD28，這可能與乙肝病毒聚合酶抗原呈遞到感染肝細(xì)胞表面較少有關(guān)，因此HBpAg(575-583)表位特異

12、性的CTL受到的抗原刺激比HBcAg(18-27)特異性CTL及HBeAg(335-343)特異性CTL少。進(jìn)一步進(jìn)行四色熒光分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV特異性CTLs的表型多為CD27-CD28-CD45RA-CD45RO+，表明HBV特異性CTL多處于晚期分化階段；盡管CD28-HBV特異性CTL的表型也多為CD27-CD45RA-CD45RO+，處于晚期分化階段，但CD45RA的表達(dá)在CD28-HBV特異性CTL明顯增加，提示CD28-H

13、BV特異性CTL中處于終末分化階段的細(xì)胞增多。 第三，老化的CD28-T細(xì)胞表達(dá)自然殺傷細(xì)胞相關(guān)受體，本研究檢測(cè)了NKRs中的三個(gè)受體即CD56、CD57和KIR在HBV特異性CTLs及CD28-HBV特異性CTLs的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者外周血CD56+CD8high細(xì)胞、CD57+CD8high細(xì)胞、KIR+CD8high細(xì)胞明顯增加，并且90％以上的CD56、CD57、KIR均表達(dá)于CD28-CD8high細(xì)胞

14、；50％以上的HBV特異性CTL表達(dá)CD56、CD57，10-30％的HBV特異性CTLs表達(dá)KIR；其中有85％以上的CD56、CD57、KIR表達(dá)于CD28-HBV特異性CTLs。結(jié)果表明多數(shù)的CD28-HBV特異性CTL表達(dá)CD56、CD57、KIR，提示NKRs的表達(dá)是T細(xì)胞獲得新功能的特性，并且與CD28表達(dá)丟失相關(guān)。 第四，我們用pentamer法結(jié)合胞內(nèi)Bcl-2、Ki67染色檢測(cè)HBV特異性CTLs的增殖和凋亡情

15、況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)70％以上的CD28-HBV特異性CTL表達(dá)Bcl-2，而75％以上的HBV特異性CTL沒(méi)有表達(dá)Ki-67；表明CD28-HBV特異性CTL增殖能力下降、耐受凋亡。 最后，我們檢測(cè)了慢性乙型肝炎患者CD28-HBV特異性CTLs的功能狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)利用HBV抗原肽進(jìn)行外周全血的活化檢測(cè)IFN-γ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者IFN-γ+CD8+雙陽(yáng)性T細(xì)胞頻率低下，以致于不能檢測(cè)IFN-γ+在HBV特異性CTL和CD28-

16、HBV特異性CTL的表達(dá)情況，但是可以推測(cè)CD28-HBV特異性CTL表達(dá)IFN-γ水平很低。我們還檢測(cè)了穿孔素(perforin)和顆粒酶B(GrB)的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90％的GrB表達(dá)于CD28-CD8+T細(xì)胞，85％的perforin表達(dá)于CD28-CD8+T細(xì)胞。然而利用五聚體技術(shù)結(jié)合流式多色分析卻發(fā)現(xiàn)HBV特異性CTLs和CD28-HBV特異性CTLs表達(dá)perforin和GrB水平低下。結(jié)果提示HBV特異性CTL和CD28

17、-HBV特異性CTL功能低下，不能有效行使其效應(yīng)功能。 本研究結(jié)果顯示：慢性乙型肝炎患者不表達(dá)CD28的HBV特異性CTLs數(shù)量增加，并且CD28-HBV特異性CTLs多處于晚期和終末分化階段；絕大多數(shù)CD28-HBV特異性CTL表達(dá)NKR(CD56，CD57，KIR)；CD28-HBV特異性CTL增殖能力下降并且耐受凋亡；CD28-HBV特異性CTL表達(dá)IFN-γ、perforin、GrB水平低，細(xì)胞效應(yīng)功能低下。本研究結(jié)果提