腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因修飾的雪旺細(xì)胞對(duì)大鼠視神經(jīng)損傷后的保護(hù)作用.pdf

1、視神經(jīng)損傷是臨床上常見的眼外傷類型，它可能造成患者視功能不可逆性的喪失，目前臨床上尚缺乏有效的治療手段。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglioncell，RGC)的凋亡被認(rèn)為是視神經(jīng)損傷后視功能喪失的主要原因。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)和雪旺細(xì)胞(Schwanncell，SC)在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均能促進(jìn)RGC存活，并能阻止其在視神經(jīng)損傷后發(fā)生凋亡，但二者的效果較

2、為局限。在本研究中，我們?cè)噲D應(yīng)用BDNF基因修飾的SC來(lái)探討治療視神經(jīng)損傷的新途徑。 目的(1)使用重組腺病毒將外源性BDNF基因轉(zhuǎn)移到體外培養(yǎng)的大鼠源性SC中，制備高度表達(dá)BDNF且安全可靠的SC。(2)將感染后SC與牛去細(xì)胞基質(zhì)(bovineacellularmatrix，BAM)制備成復(fù)合物，觀察其中感染后SC的生長(zhǎng)情況和BDNF的表達(dá)情況。(3)將感染后SC-BAM復(fù)合物填充至大鼠視神經(jīng)夾傷模型的損傷局部，觀察其對(duì)RGC

3、和視功能的保護(hù)作用。 方法(1)使用含有人BDNF基因的重組腺病毒載體，經(jīng)不同感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)病毒量感染體外培養(yǎng)的大鼠源性SC。RT-PCR和Westernblot檢測(cè)感染后72h的感染效率，進(jìn)一步用高感染效率下的MOI病毒量感染SC，ELISA定量分析感染后3d、6d、9d、12d、15d、18d和21d時(shí)在感染后SC培養(yǎng)液上清中BDNF的表達(dá)。(2)觀察感染后21d內(nèi)SC的生

4、長(zhǎng)狀態(tài)。采用MTT試驗(yàn)對(duì)比感染后SC和正常SC的生長(zhǎng)曲線，并采用間接熒光染色對(duì)比二者在感染后72h時(shí)胞漿中BDNF表達(dá)的情況。(3)將感染后24h的SC和BAM混合后培養(yǎng)以制備感染后SC-BAM復(fù)合物，觀察培養(yǎng)后21d內(nèi)的感染后SC的生長(zhǎng)狀態(tài)和復(fù)合物的降解情況。采用透射電鏡觀察其中的感染后SC和膠原纖維的關(guān)系。ELISA定量分析培養(yǎng)后3d、6d、9d、12d、15d、18d和21d復(fù)合物中BDNF表達(dá)的情況。(4)將大鼠分為感染后SC-

5、BAM復(fù)合物治療組、正常SC-BAM復(fù)合物治療組、單純BAM凝膠治療組、手術(shù)對(duì)照組，統(tǒng)一制作視神經(jīng)夾傷模型，夾傷后即刻將同樣大小的復(fù)合物填充至視神經(jīng)損傷局部。采用TUNEL染色的方法觀察術(shù)后3d、7d、14d和21d時(shí)視網(wǎng)膜中RGC的凋亡情況，并檢測(cè)F-VEP的P1波幅值比(術(shù)眼/健眼)。 結(jié)果(1)以感染滴度為8.16×1012pfu/L的重組腺病毒感染SC，在感染后72h時(shí)，以MOI為200感染組的感染效率最高。進(jìn)一步以MO

6、I為200的病毒量感染SC，ELISA結(jié)果表明，在各時(shí)間點(diǎn)時(shí)，感染后SC培養(yǎng)液上清中的BDNF表達(dá)量均明顯高于正常SC。(2)在感染后21d內(nèi)，感染后SC沒有出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect，CPE)，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)曲線與正常SC無(wú)明顯差異。間接熒光染色結(jié)果表明，在感染后72h時(shí)，感染后SC胞漿中BDNF表達(dá)量明顯高于正常SC。(3)感染后SC和BAM混合后在正常培養(yǎng)條件下形成凝膠狀復(fù)合物。其中的感染后SC可以正常生長(zhǎng)

7、，細(xì)胞形態(tài)略有收縮，復(fù)合物在培養(yǎng)后21d內(nèi)未完全降解。透射電鏡結(jié)果表明，感染后SC可以黏附在BAM中的膠原纖維上生長(zhǎng)。ELISA結(jié)果表明，在各時(shí)間點(diǎn)時(shí)，感染后SC-BAM復(fù)合物中的BDNF表達(dá)量均高于正常SC-BAM復(fù)合物，其中以培養(yǎng)18d時(shí)最為明顯。(4)在大鼠視神經(jīng)夾傷局部填充感染后SC-BAM復(fù)合物術(shù)后7d、14d和21d時(shí)TUNEL染色陽(yáng)性的RGC數(shù)目明顯低于對(duì)照組，分別為36.35±12.53/mm、30.25±17.04/m

8、m和35.99±10.38/mm；F-VEP的P1波幅值比(術(shù)眼/健眼)在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)時(shí)均高于對(duì)照組，分別為0.63±0.19、0.84±0.12、0.73±0.21和0.69±0.16。 結(jié)論(1)感染后SC能夠?qū)⒅亟M腺病毒介導(dǎo)的外源性BDNF基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄翻譯，最終表達(dá)的BDNF量高于正常SC，并且能夠維持較長(zhǎng)時(shí)間(至少3w)。(2)感染后SC的生物學(xué)性狀較正常SC未有明顯變化，提示重組腺病毒介導(dǎo)的方式在較長(zhǎng)時(shí)間(至少3w)內(nèi)

9、是安全的。(3)感染后SC-BAM復(fù)合物為感染后SC提供了良好的生長(zhǎng)環(huán)鏡，其結(jié)構(gòu)有利于感染后SC表達(dá)的BDNF緩慢釋放。(4)大鼠視神經(jīng)夾傷后局部填充感染后SC-BAM復(fù)合物，其視網(wǎng)膜中RGC凋亡得以抑制，視神經(jīng)功能得以維持，說(shuō)明其中的BDNF基因修飾的SC(即感染后SC)對(duì)損傷后的視神經(jīng)發(fā)揮了保護(hù)作用。 創(chuàng)新點(diǎn)(1)成功將外源性BDNF基因轉(zhuǎn)移到體外培養(yǎng)的大鼠源性SC中，國(guó)內(nèi)研究中未見報(bào)道。(2)成功將轉(zhuǎn)移有外源性BDNF基因