布-加綜合征下腔靜脈病變隔膜形態(tài)學和相關基因篩選研究.pdf

1、布-加綜合征(Budd Chiari syndrome,B-CS)的病因和發(fā)生機制目前尚不明確。各國學者從不同的角度開展研究,出現(xiàn)了“先天發(fā)育畸形學說”、“血栓形成學說”、“機械損傷學說”和“感染學說”等多種病因學說理論。隨著對病因研究的深入,人們逐漸發(fā)現(xiàn)B-CS的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素參與的復雜過程。目前一般認為B-CS發(fā)病與地域關系密切,西方國家大多數(shù)與有明確病因的凝血機制異常相關(繼發(fā)性B-CS),而在我國多為原發(fā)性B-CS,可能

2、與性別、年齡、居住的環(huán)境、勞動強度、生活狀況、衛(wèi)生條件、肝臟功能以及基因突變等都有關系。由于B-CS病變隔膜不易獲得,國內外對B-CS的病因學研究多集中在凝血機制異常和單個基因突變方面,而對病變隔膜的來源、形成、發(fā)生和發(fā)展等方面認識有限。
　　 本課題通過大體觀察B-CS患者下腔靜脈病變隔膜特征,利用光鏡、電鏡對比觀察病變隔膜與成熟皮膚瘢痕組織(以下簡稱瘢痕組織)、正常下腔靜脈壁的組織結構異同,并進行免疫組織化學檢查,觀察病變隔

3、膜組織中的化學變化、成纖維細胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptor,FGFR)、平滑肌細胞增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達和細胞凋亡情況。同時應用基因芯片篩選出B-CS下腔靜脈病變隔膜和正常下腔靜脈壁中差異表達的基因,并初步探討其基因表達譜差異表達基因與病變隔膜形成關系。從形態(tài)學、細胞因子、細胞凋亡和基因表達角度探討B(tài)-CS

4、的發(fā)病機制,為進一步深入研究布-加綜合征的發(fā)病機制提供依據(jù)并奠定分子生物學基礎。
　　 論文共分2部分:
　　 方法:
　　 肉眼觀察2007年10月.2009年12月根治性切除手術切除的11例B-CS下腔靜脈病變隔膜形態(tài)特征,利用光鏡、電鏡對比觀察病變隔膜與10例瘢痕組織、12例正常肝后段下腔靜脈壁的組織結構異同,同時進行免疫組織化學檢查,研究病變隔膜中組織學變化、FGFR.、PCNA和凋亡細胞的表達情況,并與

5、瘢痕組織和正常下腔靜脈壁對照。
　　 結果:
　　 1大體觀察
　　 1.1手術中見病變隔膜位于下腔靜脈入右心房3.0cm范圍內,其中6例在2.0cm處。隔膜呈白色,邊緣較厚,中央偏薄,表面與IVC內膜相連。8例呈現(xiàn)橫行分布,3例斜行分布。9例切除時隔膜與血管壁分離較易,切除隔膜后創(chuàng)面基本光滑,2例不易分離,行銳性切除,創(chuàng)面粗糙。9例隔膜下方IVC有附壁血栓。5例病變隔膜局部有鈣化。術后用水沖洗后見病變隔膜白色,

6、外表光滑,隔膜邊緣厚度5.0mm-9.0mm,平均(6.8±1.5)mm,中央厚度3.0mm-6.0mm,平均(4.6±1.0)mm。
　　 1.2瘢痕組織呈灰白色半透明狀,表面平整光滑,質地較硬,略高出皮膚,手術切除后見瘢痕組織波及皮膚全層。
　　 1.3正常下腔靜脈血管內膜呈白色,1例發(fā)現(xiàn)Eustachian瓣。
　　 2光鏡下組織形態(tài)學觀察
　　 2.1病變隔膜組織由粗大的均質膠原纖維及成纖維細胞構

7、成,膠原排列紊亂,部分膠原纖維呈透明變性。其中微血管較少,大部分呈閉合狀態(tài)。隔膜邊緣為不等程度的纖維結締組織增生、平滑肌細胞增生和透明樣變性,9例伴有附壁血栓；8例透明樣變性；5例有組織鈣化；7例有炎細胞浸潤,以淋巴細胞浸潤為主,另有漿細胞和嗜酸性粒細胞浸潤,少量單核細胞和中性細胞浸潤:偶可見肉芽組織和新生血管等病理改變。
　　 2.2瘢痕組織:真皮層變薄,少量散的纖維細胞和大量的膠原纖維,膠原纖維平行或交錯分布,并相互融合,形

8、成粗大的膠原纖維束。小血管稀少,其間可見炎性細胞浸潤。未見毛囊和汗腺等皮肽附屬器結構。
　　 2.3可見下腔靜脈壁的內膜、中膜和外膜三層結構,管腔面為一層完整的內皮細胞覆蓋,內皮細胞呈扁平圓形,單層排列整齊,細胞間結合緊密,胞核呈橢圓形。內皮下平滑肌層較厚,細胞多為梭形,肌細胞之間有少量細胞間質為膠原纖維和少量彈力纖維,中、外膜分界不明顯。
　　 3 FGFR、PCNA表達和AC情況
　　 病變隔膜、瘢痕組織和正

9、常下腔靜脈(壁)中均有FGFR及PCNA陽性細胞。三種組織中FGFR的陽性表達率分別為17.30±1.54、18.50±1.64和8.80±1.24:PCNA在上述三中組織中陽性表達率分別為40.76±3.67、38.46±2.33和22.10±2.01。病變隔膜組和瘢痕組間FGFR和PCNA相比差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；病變隔膜組和正常下腔靜脈組相比FGFR和PCNA陽性表達均增高(P均<0.05)。
　　 凋亡細胞

10、數(shù)在病變隔膜中的表達與瘢痕組織中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但在兩者中的表達均低于在正常下腔靜脈(壁)中的凋亡細胞數(shù)(P<0.05)。
　　 4電鏡觀察(超微結構)
　　 4.1病變隔膜組織中可見較多的纖維細胞,表面有少量內皮細胞,呈扁平狀,核形狀不規(guī)則。內皮細胞內線粒體大部分嵴和膜脫落融合、模糊不清或缺失,粗面內質網輕度擴張,可見顆粒融合和脫顆粒現(xiàn)象。內膜部分脫落或斷裂,向管腔內突起。偶見凋亡細胞,但體積縮小。<

11、br>　　 4.2瘢痕組織中成纖維細胞周圍分布大量膠原纖維,膠原纖維排列紊亂,成纖維細胞呈梭狀,細胞表面有粗大的突起,核大而呈橢圓,核仁明顯,胞漿內可見粗面內質網；核蛋白體豐富,線粒體多,為橢圓形或圓形；胞膜內側可見大量的分泌小泡。
　　 4.3正常下腔靜脈壁內膜平整,內皮細胞扁平圓形,排列規(guī)則,呈條帶狀分布,與血管長軸方向一致,細胞間結合緊密。血管內皮細胞為單層扁平上皮細胞,多數(shù)內皮細胞未見細胞核。內皮細胞內可見線粒體、粗面

12、內質網及吞飲小泡,內皮細胞下為少量排列較稀疏的膠原纖維及彈性纖維。內皮下平滑肌層較厚,平滑肌細胞排列整齊,細胞核梭形,細胞質內見較多的肌絲及少量線粒體、粗面內質網。外膜見有膠原纖維、脂肪細胞及毛細血管。
　　 方法:
　　 取3例手術切除新鮮凍存的B-CS下腔靜脈病變隔膜和3例正常肝后段下腔靜脈壁(入右心房口下方),提取總的RNA,鑒定其質量,使用Agilent熒光標記,經基因芯片進行雜交,雜交后的芯片用激光掃描儀進行掃

13、描,用軟件提取和分析數(shù)據(jù),用t檢驗篩選病變隔膜和正常下腔靜脈壁組織中的差異表達的基因(以P<0.05和FC>10為條件),并用相關軟件預測可能的靶基因譜。
　　 結果:
　　 病變隔膜與正常下腔靜脈壁組織中的差異表達的基因有9371個,其中4986個在病變隔膜基因表達譜中出現(xiàn)上調,4385個出現(xiàn)下調。一些文獻中報道與B-CS病變隔膜形成相關的一些基因如FVL、JAK2-V617F和G20210A等均有表達。