小黑麥天冬酰胺合成酶基因克隆及功能驗證.pdf

1、目的：植物在應(yīng)對干旱、鹽、礦物質(zhì)元素脅迫和病菌侵害時，其天冬酰胺合成酶基因表達量會提高，并積累大量天冬酰胺。天冬酰胺不僅是植物體內(nèi)運輸新合成氮的重要載體，也是植物轉(zhuǎn)移衰老器官中氮源的重要載體。天冬酰胺合成酶基因的表達受到逆境環(huán)境因素誘導(dǎo)，是潛在的抗逆基因。本研究擬從適應(yīng)性廣泛的六倍體小黑麥中克隆天冬酰胺合成酶基因，并對其功能以及在鹽脅迫下的表達特點進行分析，以進一步明確小黑麥天冬酰胺合成酶基因與耐鹽性的關(guān)系。
　　方法：前期試驗中

2、利用cDNA-AFLP技術(shù)從六倍體小黑麥中篩選到一條差異表達基因片段，本研究通過電子克隆技術(shù)獲得了小黑麥天冬酰胺合成酶基因（TriAS），并利用生物信息學(xué)手段對其進行分析。采用實時熒光定量PCR技術(shù)對NaCl脅迫下的不同耐鹽性小黑麥品種中天冬酰胺合成酶表達特點進行了檢測；構(gòu)建了 TriAS-PZP植物表達載體，并通過沾花法侵染擬南芥和葉盤法侵染煙草獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥與煙草。觀察鹽脅迫和干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)、幼苗期和成株期的生理

3、表現(xiàn)，檢測各處理相應(yīng)階段SOD酶活性和MDA含量，同時以同樣方式檢測轉(zhuǎn)基因煙草。從而初步驗證天冬酰胺合成酶基因功能。
　　結(jié)果：⑴TriAS基因特征。利用電子克隆技術(shù),從小黑麥中克隆到的天冬酰胺合成酶基因開放閱讀框為1761bp，編碼587個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為65.83kD，在GeneBank中的注冊為KC193248。該基因預(yù)測蛋白與小麥、陸地棉等物種中天冬酰胺合成酶基因有高度同源性，初步推測其為小黑麥天冬酰胺合成酶,命名

4、為TriAS。其含有兩個保守區(qū)域，即1個谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域和1個天冬酰胺合成酶結(jié)構(gòu)域。進化分析顯示小黑麥天冬酰胺合成酶與小麥中的該酶親緣最近。⑵鹽脅迫下TriAS基因表達特點。在濃度150mmol/L NaCl脅迫下，新小黑麥3號和新小黑麥5號的基因表達都呈現(xiàn)先升高再降低趨勢，在葉中的表達量升高均顯著，但根部其表達量升高不顯著。在新小黑麥3號各組織中該酶基因表達量均高于新小黑麥5號。在新小黑麥3號中脅迫后36h表達量達到最大，而在新

5、小黑麥5號中脅迫后24h其表達量達到最大值。⑶轉(zhuǎn)TriAS基因擬南芥與煙草對逆境脅迫生理反應(yīng)在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)TriAS基因擬南芥萌發(fā)率為86.67％、幼苗根長增長0.86cm均比野生型高，但其丙二醛含量和 SOD酶活性卻均低于野生型。對轉(zhuǎn)基因型擬南芥幼苗分別進行鹽脅迫和干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長狀況優(yōu)于野生型；前者植株中丙二醛的含量遠低于后者，而SOD酶的活性卻相反。鹽脅迫和干旱脅迫轉(zhuǎn)基因型和野生型煙草時，轉(zhuǎn)基因煙草的生長狀況優(yōu)

6、于野生型；前者植株中丙二醛的含量和SOD酶活性均低于后者。
　　結(jié)論：從小黑麥中克隆出TriAS基因，編碼587個氨基酸，含有1個谷氨酰胺氨基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域和1個天冬酰胺合成酶結(jié)構(gòu)域。鹽脅迫下小黑麥天冬酰胺合成酶基因表達量將會增加，在不同小黑麥品種和同一品種不同組織間該基因表達量增強程度不同。轉(zhuǎn)基因植株在抗逆性實驗中生長狀況優(yōu)于野生型，檢測到的生理指標也證明了這一點?？梢?，所克隆的小黑麥天冬酰胺合成酶基因促進了擬南芥和煙草耐逆性能的提