放射線對(duì)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞NF-κB-P65蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景:
　　 涎腺腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma of salivary glands,ACCs)又稱(chēng)圓柱瘤(cylindroma),是一種口腔科常見(jiàn)的惡性涎腺上皮來(lái)源性腫瘤。它有著局部侵襲性強(qiáng),區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低,嗜神經(jīng)血管生長(zhǎng),因而易發(fā)生血行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性,惡性程度高,放療敏感性卻較低。正是緣于此,該腫瘤被手術(shù)切除后有著較高的復(fù)發(fā)率。如能引入基因治療的方法,提高腺樣囊性癌對(duì)放療的敏感程

2、度,則能夠給患者的生存率帶來(lái)明顯的改善。由于NF-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可能是腫瘤產(chǎn)生放療抵抗性的主要根源之一,通過(guò)基因工程技術(shù)阻斷該通路的表達(dá)活性或許能夠起到提高腺樣囊性癌細(xì)胞對(duì)放療敏感性的作用。
　　 研究目的:
　　 對(duì)唾液腺腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞進(jìn)行高能X線照射后,在不同時(shí)間點(diǎn)上,通過(guò)多種方法檢測(cè)細(xì)胞中NF-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路亞單位--p65蛋白表達(dá)程度以及細(xì)胞凋亡情況,并探究?jī)烧咧g的相關(guān)性,從而獲得一系列圖像

3、與數(shù)據(jù)資料。為進(jìn)一步的放療增敏實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及最終的臨床應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)ACC-2細(xì)胞系。在細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后,對(duì)其進(jìn)行2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy五種劑量高能X線照射。在隨后的1h、3h、6h、10h、24h、
　　 48h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,分別采用以下四種不同的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)NF-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的檢測(cè)和細(xì)胞凋亡的統(tǒng)計(jì)與觀察:通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)法觀

4、察各放射劑量組P65蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)隨時(shí)間和空間變化的情況,并拍攝留取圖片資料；通過(guò)免疫蛋白印漬(western blotting)法,對(duì)細(xì)胞中P65蛋白含量進(jìn)行半定量檢測(cè),以獲取其在受到放射線照射后表達(dá)量的遞變規(guī)律；最后,對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)上細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞檢測(cè)予以測(cè)定,進(jìn)行TUNEL(脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記技術(shù))試驗(yàn)來(lái)觀察發(fā)生凋亡細(xì)胞核的形態(tài),并拍攝留取圖片資料。以上各實(shí)驗(yàn)過(guò)程均嚴(yán)格控制細(xì)胞生長(zhǎng)的外環(huán)境,并設(shè)置

5、不接受放射線照射的空白對(duì)照組細(xì)胞,關(guān)鍵步驟另重復(fù)兩遍以減少系統(tǒng)誤差,采用必要的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行檢驗(yàn)分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)法可觀察到,正常對(duì)照組細(xì)胞中P65蛋白很少出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi),而多被定位于核周的細(xì)胞質(zhì)之中；在受到放射線照射后,該蛋白開(kāi)始大量穿過(guò)胞膜,漸漸進(jìn)入細(xì)胞核中心區(qū)域,這一過(guò)程在放射劑量高的組比放射劑量低的組進(jìn)展更快；
　　 2.借助于western blotting,

6、P65蛋白在細(xì)胞總蛋白中的含量被發(fā)現(xiàn)可隨著時(shí)間逐漸發(fā)生變化,其在各組細(xì)胞中表達(dá)的峰值大約在放療后6小時(shí)～10小時(shí)。同在照射后3小時(shí)時(shí)間點(diǎn)上,隨著放療劑量的增大,P65蛋白含量也與之俱增。
　　 3.經(jīng)過(guò)分析流式細(xì)胞檢測(cè)的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn):在不同時(shí)間點(diǎn)上,細(xì)胞凋亡率不斷地改變,該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)被繪制成曲線后,可見(jiàn)各放射劑量組細(xì)胞凋亡曲線的最低點(diǎn)位于放療后10小時(shí)；同樣在照射后3小時(shí)時(shí)間點(diǎn)上,細(xì)胞凋亡率隨放射劑量的增加而有所降低,對(duì)照west

7、ern b10tting結(jié)果,則表現(xiàn)出了其相對(duì)于P65蛋白含量的負(fù)相關(guān)關(guān)系(應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)法進(jìn)行放射線照射劑量強(qiáng)度與細(xì)胞凋亡率之間關(guān)系的分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05,結(jié)果P=0.010<0.05)。
　　 4.發(fā)生凋亡的細(xì)胞在TUNEL試驗(yàn)中被觀察到了較為典型的形態(tài)學(xué)變化,如染色體濃集、核碎裂以及凋亡小體等,凋亡細(xì)胞比率的變化趨勢(shì)與流式細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果相同。
　　 研究結(jié)論:
　　 高能X射線與A

8、CC-2細(xì)胞中P65蛋白的表達(dá)變化規(guī)律之間有著一定的時(shí)間--劑量效應(yīng)關(guān)系。即細(xì)胞受到放射線照射之后,隨時(shí)間推移,P65蛋白在空間上濃集的部位不斷遷移,最終富集作用于細(xì)胞核相關(guān)區(qū)域,即特定部位與特定時(shí)間相對(duì)應(yīng)；其在總蛋白中的含量亦不斷改變,即特定含量對(duì)應(yīng)特定時(shí)間,此為放射線與P65蛋白表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。而放射線劑量的增大可以加速同一時(shí)間點(diǎn)上蛋白濃集部位的遷移過(guò)程,并可使蛋白含量隨之升高,此為二者正相關(guān)的劑量效應(yīng)關(guān)系。照射后各組細(xì)胞凋亡率