小鼠神經(jīng)干細(xì)胞免疫原性的研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：小鼠神經(jīng)千細(xì)胞體外培養(yǎng)和鑒定
　　 本實(shí)驗(yàn)借鑒了大量研究者的成功及失敗的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)了本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)十年來(lái)的體會(huì)，探索了一套行之有效的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定方法。
　　 材料和方法：
　　 1.材料:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c近交系新生鼠由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、B27添加劑、胰蛋白酶均購(gòu)于Gibco公司，表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)

2、因子(bFGF)購(gòu)于Sigma公司。一次性塑料培養(yǎng)瓶為Orange公司產(chǎn)品。
　　 2.方法
　　 2.1神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)
　　 取BALB/c新生鼠，以戊巴比妥鈉麻醉后處死，解剖并分離海馬組織，以PH為7.4的PBS緩沖液漂洗干凈后，將組織碎片置于試管中，加入0.5g/L的胰酶和0.12g/L的EDTA，37℃消化15min，然后以玻璃吸管吹散，細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，80％以上細(xì)胞活力良好。利用無(wú)血清培養(yǎng)基，及瓊脂糖包被

3、的培養(yǎng)瓶，懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，傳代并做單克隆擴(kuò)增和分化。
　　 2.2神經(jīng)干細(xì)胞鑒定
　　 應(yīng)用CD133免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。
　　 結(jié)果：
　　 1.神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)
　　 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)第一天，呈單細(xì)胞懸液，第二天細(xì)胞逐漸聚集成小的神經(jīng)球，第三天左右出現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞克隆，神經(jīng)球逐漸增大，最終形成巨大神經(jīng)球，中心神經(jīng)干細(xì)胞因難以獲得養(yǎng)分，此時(shí)需要重新消化，傳代培養(yǎng)。
　　 2.神

4、經(jīng)干細(xì)胞的鑒定
　　 無(wú)血清培養(yǎng)條件下，按克隆密度種植的神經(jīng)干細(xì)胞分裂增殖逐漸形成克隆球，表明本實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)干細(xì)胞具有自我增殖能力。神經(jīng)干細(xì)胞克隆球球在含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，逐漸發(fā)生貼壁生長(zhǎng)，并分化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及少量神經(jīng)元細(xì)胞，表明本實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)干細(xì)胞具有多向分化潛能。神經(jīng)干細(xì)胞克隆球經(jīng)經(jīng)短時(shí)消化及機(jī)械吹散后，形成神經(jīng)干細(xì)胞小克隆球及單細(xì)胞懸液，甩片收集后行CD133免疫熒光染色，均呈陽(yáng)性，表明本實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞

5、均為神經(jīng)干細(xì)胞。結(jié)論
　　 利用機(jī)械分離法和改進(jìn)的酶消化法相結(jié)合的細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，采用加入絲裂原的無(wú)血清培養(yǎng)基，及瓊脂糖凝膠包被的培養(yǎng)瓶，選擇適當(dāng)?shù)慕臃N密度和傳代培養(yǎng)時(shí)機(jī)，能夠長(zhǎng)期獲得足夠數(shù)量的高純度神經(jīng)干細(xì)胞。
　　 第二部分：?jiǎn)蜗蚧旌狭馨图?xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)檢測(cè)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞與同一個(gè)體肝臟細(xì)胞免疫原性的差異
　　 本研究試圖探討小鼠神經(jīng)干細(xì)胞免疫原性與自身肝臟細(xì)胞之間的差異，從而了解其免疫原性的強(qiáng)弱，以利于解決神經(jīng)

6、干細(xì)胞移植中的免疫排斥問(wèn)題。
　　 材料和方法：
　　 1.材料
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6近交系小鼠和BALB/c近交系新生鼠均由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　 2.方法
　　 2.1神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定
　　 取BALB/c新生鼠，以戊巴比妥鈉麻醉后處死，解剖并分離海馬組織，加入0.5g/L的胰酶和O.12g/L的EDTA，37℃消化15min，然后以玻璃吸管吹散。利用無(wú)血清培養(yǎng)，

7、懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，傳代并做單克隆擴(kuò)增和分化，應(yīng)用CD133免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。
　　 2.2主動(dòng)免疫C57BL/6近交系小鼠
　　 將制備的NSCs，以絲裂霉素滅活后分別腹腔免疫C57BL/6小鼠15只，l×106細(xì)胞/只，1次/周，連續(xù)3周，最后1次免疫后第4天處死小鼠。
　　 2.3單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)
　　 無(wú)菌條件下摘取C57BL/6免疫小鼠小鼠脾臟，制備T淋巴細(xì)胞懸液。調(diào)整T淋

8、巴細(xì)胞懸液密度為l×109/L，以每孔100μL體積加入圓底96孔板，作為應(yīng)答細(xì)胞。然后將制備的C57BL/6小鼠神經(jīng)干細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2x108/L后，絲裂霉素處理30 min，PBS洗滌后用培養(yǎng)液重懸，再按每孔100μl加入到已鋪有受體淋巴細(xì)胞的96孔板中，作為刺激細(xì)胞。刺激細(xì)胞與應(yīng)答細(xì)胞比例為1:5，使神經(jīng)干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞充分接觸。再置于孵箱中培養(yǎng)120h。培養(yǎng)結(jié)束前16h，加入[3H]-TdR。
　　 2.4

9、液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)
　　 以多頭細(xì)胞收集儀將細(xì)胞收集到濾紙上，液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)摻入[3H]-TdR后形成的每分鐘脈沖數(shù)，即cpm值，每組結(jié)果以3孔的平均值計(jì)算。
　　 2.5肝細(xì)胞對(duì)照組
　　 取BALB/c新生鼠，無(wú)菌條件下摘取肝臟，應(yīng)用seglen灌流法制備肝細(xì)胞，上述同樣方法腹腔免疫C57BL/6小鼠，收獲T淋巴細(xì)胞。然后取同一批肝細(xì)胞，以絲裂霉素滅活后與收獲T淋巴細(xì)胞行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，用[3H]-T

10、dR標(biāo)記并檢測(cè)cpm值。
　　 2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 計(jì)量資料用X±S表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 與肝細(xì)胞對(duì)照組比較，NSC組合成代謝中攝取的[3H]-TdR較少，因而液閃計(jì)數(shù)儀檢測(cè)所得cpm值較小。兩組cpm值的比較，P<0.001，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 綜上所述，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠神經(jīng)干細(xì)胞免疫原性明顯低于同一個(gè)體的肝細(xì)胞。長(zhǎng)期的肝

11、移植基礎(chǔ)及臨床研究表明，肝細(xì)胞具有較弱的免疫原性。因而我們有理由推測(cè)，神經(jīng)干細(xì)胞的免疫原性低于其普通的體細(xì)胞。鑒于肝細(xì)胞的免疫原性已經(jīng)得到廣泛研究證實(shí)，所以本實(shí)驗(yàn)選擇了肝細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，但僅以肝細(xì)胞作為對(duì)照是不夠的，因此這一方面尚有待于進(jìn)一步深入研究。
　　 第三部分:應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達(dá)并比較炎癥因子IL-2存在條件下MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達(dá)量的變化
　　 本研究試圖

12、檢測(cè)體外培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞主要組織相容性抗原的表達(dá)量，以及炎癥因子存在條件下其表達(dá)量的變化。從而了解小鼠神經(jīng)干細(xì)胞免疫原性的特點(diǎn)，為臨床解決神經(jīng)干細(xì)胞移植中的免疫排斥問(wèn)題提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料和方法：
　　 1.材料
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c近交系新生鼠均由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、B27添加劑、胰蛋白酶均購(gòu)于Gibco公司，表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及白介素-2購(gòu)于Si

13、gma公司。一次性塑料培養(yǎng)瓶為Orange公司產(chǎn)品，小鼠MHC-Ⅰ單克隆抗體及小鼠MHC-Ⅱ單克隆抗體均購(gòu)自eBioscience。
　　 2.方法
　　 2.1神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定
　　 取BALB/c新生鼠，以戊巴比妥鈉麻醉后處死，解剖并分離海馬組織，加入0.5g/L的胰酶和O.12g/L的EDTA，37℃消化15min，然后以玻璃吸管吹散。利用無(wú)血清培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，傳代并做單克隆擴(kuò)增和分化，應(yīng)用C

14、D133免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定神經(jīng)干細(xì)胞。
　　 2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達(dá)
　　 取生長(zhǎng)良好的BALB/c神經(jīng)干細(xì)胞1瓶，離心收集細(xì)胞，消化30分鐘左右，間斷輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，SFM重懸細(xì)胞，移入流式試管，隨機(jī)分為12管，細(xì)胞數(shù)約5000/管。先取2管分別加入“FITC標(biāo)志的MHC-Ⅰ抗體/PE標(biāo)志的同種型對(duì)照”和“PE標(biāo)志的MHC-Ⅱ抗體/FITC標(biāo)志的同種型對(duì)照”各1

15、微升，設(shè)置機(jī)器本底。然后將其余10管離心后，加入FITC標(biāo)記的anti-mouse MHCclassⅠ及PE標(biāo)記的anti-mouse MHC classⅡ各1微升，常溫下作用15分鐘。以PBS400微升洗滌一遍后，再以PBS400微升重懸，然后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NSC中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞比例。取10管的平均值為神經(jīng)干細(xì)胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞比例。
　　 2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)炎癥因子IL-2存在條件下神經(jīng)干

16、細(xì)胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達(dá)量的變化
　　 取生長(zhǎng)良好的BALB/c神經(jīng)干細(xì)胞3瓶，消化后接種入5ml培養(yǎng)瓶，共25瓶。隨機(jī)分成5組，每組5瓶：按時(shí)間點(diǎn)：24小時(shí)、3天、7天、14天，以lOng/ml的濃度，分別加入IL-2;另設(shè)陰性對(duì)照組。收集各組細(xì)胞，移入流式試管，細(xì)胞數(shù)約5000/管。然后將各組細(xì)胞離后，每管加入FITC標(biāo)記的anti-mouse MHC classⅠ及PE標(biāo)記的anti-mouse MHC class

17、Ⅱ（I-A/I-E)各1微升，分別標(biāo)記MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ，常溫下作用15分鐘。然后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NSC中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞比例。取5管的平均值為每組神經(jīng)干細(xì)胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ陽(yáng)性細(xì)胞比例。
　　 2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 計(jì)量資料用X±S表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達(dá)結(jié)果顯示，僅約18.46％增殖期NS

18、C表達(dá)上述二類分子，而達(dá)81.54％的增殖期NSC沒(méi)有檢測(cè)到這二類分子的表達(dá)，且MHC-Ⅰ類分子的平均表達(dá)比例略高于MHC-Ⅱ類分子。
　　 2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)炎癥因子IL-2存在條件下神經(jīng)干細(xì)胞MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達(dá)量的變化結(jié)果顯示，炎癥因子IL-2存在條件下，各組與對(duì)照組相比，MHC-Ⅰ類分子及MHC-Ⅱ類分子的比例均有不同程度的上調(diào)，P<0.01，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作用24小時(shí)至14天，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，神經(jīng)干細(xì)胞MHC