大白菜CMS96細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子特性及育種應(yīng)用研究.pdf

1、大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis)起源于我國,是最具中國特色、國內(nèi)播種面積最大、產(chǎn)量最高的重要葉用蔬菜.我國大白菜資源豐富、品種類型多樣,商品菜生產(chǎn)已經(jīng)基本實(shí)現(xiàn)周年供應(yīng).由于大白菜具有明顯的雜種優(yōu)勢,當(dāng)前主栽品種幾乎均為雜種一代.利用雄性不育系生產(chǎn)一代雜種已經(jīng)成為大白菜育種的一種發(fā)展趨勢,而細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育和利用是以營養(yǎng)器官為食用對(duì)象的大白菜等蔬菜雜種優(yōu)勢育種的理想途徑.目前,大白菜

2、細(xì)胞質(zhì)雄性不育主要來源有3種:蘿卜Ogu CMS、甘藍(lán)型油菜Pol CMS和新型甘藍(lán)型油菜CMS96.以往的研究主要集中在對(duì)單一大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系進(jìn)行比較研究,本研究從分子生物學(xué)、同工酶或蛋白質(zhì)、細(xì)胞學(xué)和植物學(xué)等方面初步探索3種大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Ogu CMS、Pol CMS和CMS96)的不育特征、特性,研究大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育這一具有重要理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的遺傳現(xiàn)象本質(zhì),特別是探索大白菜CMS96不育系的敗育機(jī)理,為

3、更好地在大白菜育種中應(yīng)用CMS96細(xì)胞質(zhì)雄性不育源奠定基礎(chǔ). 基于上述情況,本論文開展了以下五個(gè)方面的研究工作,獲得的主要結(jié)論如下: 1.采用RAPD和AFLP技術(shù),對(duì)3組11份大白菜不育系、保持系的mtDNA以及nDNA進(jìn)行多態(tài)性研究,RAPD和AFLP結(jié)果的聚類分析表明,大白菜CMS96和Ogu CMS不育系更為相近,遺傳相似性較大. 篩選了153個(gè)RAPD隨機(jī)引物,其中4個(gè)RAPD引物OPB20、OP004

4、、OPU04.和OPAH16獲得與大白菜Ogu CMS和CMS96不育系相關(guān)的20條RAPD片段;其中1個(gè)RAPD引物OPB06獲得僅與大白菜Ogu CMS不育系相關(guān)的3條RAPD片段.將OPAH16引物在大白菜Ogu CMS、CMS96不育系擴(kuò)增得到的1300bp片段和在全部材料擴(kuò)增得到的900bp片段轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記SCAR-1300和SCAR-900;篩選了64組AFLP引物,其中3組引物E-ACC/M-CAT 500、E-AC

5、G/M-CTG 650和E-ACT/M-CTT370獲得與大白菜CMS96不育系相關(guān)的6條AFLP片段;2組引物E-ACG/M-CAT 540和E-ACT/M-CAT 610獲得與大白菜Ogu CMS不育系相關(guān)的6條AFLP 片段;由5組引物獲得與大白菜CMS96和Ogu CMS不育系相關(guān)的22條AFLP片段;由5組引物獲得與3種大白菜不育系相關(guān)的26條AFLP片段. 2.采用基于同源序列基因擴(kuò)增法,利用設(shè)計(jì)的7組引物PCR擴(kuò)增

6、11份大白菜不育系和保持系mtDNA,結(jié)果表明,由atp6、orf222和orf224單一引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或atp6、orf222二組混合引物多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以將3種大白菜不育系以及保持系區(qū)分開;綜合已獲得的研究結(jié)果,提出大白菜CMS96不育系的不育基因?yàn)镺gu CMS orf138和Nap CMS orf222/nad5c二組已有不育嵌合基因有機(jī)結(jié)合、重組形成的新型不育嵌合基因;推測大白菜CMS96原始不育源的獲得是甘藍(lán)型油菜O

7、gu CMS和Nap CMS不育系原生質(zhì)體對(duì)稱融合的結(jié)果. 利用7組引物PCR擴(kuò)增11份大白菜不育系和保持系mtDNA,獲得多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果;RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證片段的特異性;克隆、測序和同源性比較,研究特異片段的核苷酸和氨基酸序列特性.結(jié)果表明,7組引物在11份大白菜材料中均有擴(kuò)增產(chǎn)物,除了atp9和cosⅠ引物外,其余5組引物擴(kuò)增產(chǎn)物均存在差異.atp6引物擴(kuò)增的200bp產(chǎn)物可以將大白菜Ogu CMS不育系與其它不育系

8、、保持系區(qū)別開;orf224引物只在大白菜Pol CMS不育系中有擴(kuò)增產(chǎn)物;agpA和orf138引物擴(kuò)增產(chǎn)物可將大白菜Ogu CMS、CMS96不育系與其余不育系、保持系區(qū)別開; orf222引物僅在大白菜Pol CMS和CMS96不育系中有擴(kuò)增產(chǎn)物,可以將二者與其它不育系和保持系區(qū)別開,但orf222引物擴(kuò)增產(chǎn)物存在3點(diǎn)不同:前者序列長度為675bp,具有ORF224開放閱讀框,沒有保守結(jié)構(gòu)域;后者序列長度為669bp,具有ORF2

9、22開放閱讀框,與Nap CMS的orf222、nad5c核甘酸序列同源性為99﹪,具有YFM16保守結(jié)構(gòu)域;同時(shí),利用orf138和orf222二組引物的5種組合擴(kuò)增大白菜CMS96不育系mtDNA,獲得3組特異擴(kuò)增產(chǎn)物. 通過atp6和orf222二組引物混合,多重PCR擴(kuò)增11份大白菜mtDNA,可以將大白菜3種不育系和保持系僅一次PCR反應(yīng)完全區(qū)別開,建立了一種快速鑒定3種大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系的分子技術(shù)方法:所

10、有保持系僅擴(kuò)增出1條800bp帶型,可以作為保持系的區(qū)分帶型;大白菜Pol CMS不育系可擴(kuò)增出3條帶型,其中1500bp和2300bp為其特有帶型,二者不是單引物擴(kuò)增的產(chǎn)物,而是atp6和orf222引物混合后綜合擴(kuò)增的產(chǎn)物:大白菜Ogu CMS不育系可擴(kuò)增出3條帶型,其中200bp為其特有帶型.大白菜Ogu CMS不育系多重PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與單一引物的擴(kuò)增結(jié)果相同,即只有atp6引物的擴(kuò)增結(jié)果;大白菜CMS96不育系可擴(kuò)增出2條帶型

11、:700bp和800bp,其中700bp為其特異帶型.大白菜CMS96不育系多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是單一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的簡單累加. 3.應(yīng)用水平板等電聚焦(IEF)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù),開展了2組8份大白菜不育系和保持系花、4級(jí)蕾、葉片的EST、ACP、POD同工酶和全蛋白的比較研究.結(jié)果表明,除EST外,3種大白菜不育系和保持系A(chǔ)CP、POD同工酶和全蛋白酶帶存在差異. EST同工酶研究表明,供試材料EST酶帶沒有差異,

12、均有10～11條EST酶帶;POD同工酶研究表明,8份大白菜不育系和保持系花和4級(jí)蕾的POD酶帶存在差異:3種不育系的C酶帶活性比保持系C酶帶活性強(qiáng),Ogu CMS和CMS96不育系的C酶帶活性又比Pol CMS不育系的C酶帶活性強(qiáng).所有不育系大于0.45cm蕾的C酶帶活性比小于0.45cm蕾的C酶帶活性強(qiáng).但2組大白菜CMS96不育系的POD酶帶不一致:第2組CMS96不育系B酶帶活性明顯比第3組CMS96不育系的B酶帶活性強(qiáng),也比同

13、一組其它材料的B酶帶活性強(qiáng).第2組中,CMS96不育系比同一組其它材料多出1條A酶帶,并與第3組材料的A酶帶相同.第3組中,4種材料POD酶帶數(shù)相同;ACP同工酶研究表明,大白菜Ogu CMS不育系花具有活性強(qiáng)的A、B酶帶.大白菜Ogu CMS和CMS96不育系大于0.45cm蕾具有活性強(qiáng)的A、B酶帶.保持系大于0.45cm蕾具有活性強(qiáng)的C、D酶帶.所有供試材料小于0.45cm蕾的ACP酶帶沒有差異,均有5～6條ACP酶帶;全蛋白研究表

14、明,保持系0.35～0.55cm蕾具有活性強(qiáng)的A酶帶,3種不育系的全蛋白酶帶沒有差異. 4.采用透射和掃描電鏡,觀察大白菜CMS96不育系、保持系的花藥、小孢子發(fā)育過程和表面結(jié)構(gòu).初步認(rèn)為,大白菜CMS96不育系的主要敗育特征為:在花粉母細(xì)胞初期,絨氈層與中層細(xì)胞提前分開,花粉母細(xì)胞雖然可以正常減數(shù)分裂,但形狀不規(guī)則,花粉母細(xì)胞之間空隙大;大白菜CMS96不育系可以形成花粉,也具有花粉的紋蝕和花粉壁結(jié)構(gòu),但花粉內(nèi)部營養(yǎng)物喪失,只

15、有空癟花粉粒,而且粘附在花藥內(nèi),不散開. 5.通過比較大白菜CMS96不育系、保持系以及試配的F1代主要植物學(xué)性狀,進(jìn)一步肯定了大白菜CMS96不育系和其F1代具有如下優(yōu)越性:轉(zhuǎn)育容易、不育度、不育株率100﹪、多代回交不易退化、配合力強(qiáng)、雜交種純度可達(dá)100﹪等.獲得性狀優(yōu)良、穩(wěn)定的大白菜CMS96不育系31份;繁殖并示范推廣大白菜CMS96不育系配制的4個(gè)組合:03-10、04-2、05-4和06-5;初步提出了大白菜CMS