低氧誘導(dǎo)因子-1α在缺血后處理減輕心肌缺血-再灌注損傷中的作用.pdf

1、研究背景和目的: 世界衛(wèi)生組織在《2007年全球衛(wèi)生統(tǒng)計報告》中預(yù)測，到2030年缺血性心臟病將成為繼癌癥之后導(dǎo)致人類死亡的第二大疾病，而冠狀動脈梗塞引起的心肌缺血是缺血性心臟病最重要的單因素致死原因。心臟是一個耗氧量很大的器官，且心肌不能進行無氧代謝，所以，當(dāng)心肌缺血時，由于氧供給不能滿足氧需求，會引起心肌細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致心肌舒縮功能障礙。因此，冠脈梗塞后及早再通閉塞的冠狀動脈，有效恢復(fù)缺血心肌的血液灌注，是減少缺血性心肌損傷最有效

2、的方法。然而動物實驗和臨床觀察均證明，血管再通本身能引起額外的心肌損傷，即再灌注損傷，直接影響病人的預(yù)后。因此，如何減輕缺血/再灌注損傷，最大限度地保護缺血心肌，是有效治療缺血性心臟病的關(guān)鍵。 一、后處理對缺血/再灌注心肌組織HIF-1α表達的影響。 目的: 1、觀察后處理對缺血/再灌注心肌組織HIF-1α表達的影響； 2、分析HIF-1α表達水平與再灌注心肌損傷之間可能存在的關(guān)系。 方法：

3、 1、選取成年Wistar大鼠30只，隨機分為以下3組； (1)偽手術(shù)組(Sham，n=10)； (2)缺血/再灌注組(Control，n=10)； (3)缺血后處理組(PostC，n=10)。 2、心肌梗死面積測定：采用Evansblue和TTC雙染法，正常的心肌組織被染成藍色，缺血但未梗死的心肌組織被染為紅色，梗死的心肌組織為白色。圖像分析測定各區(qū)域面積。危險區(qū)面積(AAR/LV，％)=(危險區(qū)總面

4、積/左心室面積)×100％心梗面積(An/AAR，％)=(梗死區(qū)面積/危險區(qū)總面積)×100％ 3、測定血清肌酸激酶(CK)的活性來進一步反映心肌損傷情況； 4、分別采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)和Caspase-3活性測定法檢測大鼠心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生情況； 5、用Western—blot法檢測大鼠心肌組織中HIF-1α與iNOS的蛋白表達水平； 6、用免疫組化法測定心肌組織中HIF-1α的定位

5、及表達； 7、用real—TimePCR法檢測大鼠心肌組織中HIF-1α與iNOSmRNA的表達水平。 小結(jié)： 1、與缺血/再灌注相比，后處理使心肌組織中HIF-1α蛋白水平顯著上調(diào)； 2、后處理減輕心肌缺血/再灌注損傷可能與其上調(diào)HIF-1α表達有關(guān)。 二、HIF-1α表達改變可以影響后處理對缺血心肌的保護效應(yīng)。 目的: 1、采用藥理學(xué)方法(DMOG，脯氨酸羥化酶的抑制劑)使心肌

6、組織中HIF-1α表達上調(diào)，觀察其對后處理減輕心肌缺血/再灌注損傷的影響； 2、模擬心肌缺血/再灌注，在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞上制備缺氧/復(fù)氧及缺氧后處理模型，然后利用RNAi技術(shù)使心肌細(xì)胞的HIF-1α基因沉默，觀察后處理對缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞損傷的影響。 方法: 1、選取成年Wistar大鼠40只，隨機平均分為以下4組； (1)缺血/再灌注組(Control，n=10)； (2)DMOG+缺血/再灌

7、注組(DMOG+Control，n=10)； (3)生理鹽水+后處理組(Vehicle+PostC，n=10)； (4)DMOG+后處理組(DMOG+PostC，n=10)。 2、心肌梗死面積測定：采用Evanseblue和TTC雙染法測定缺血/再灌注所致的心肌梗死面積； 3、測定血清肌酸激酶(CK)的活性來進一步反映心肌損傷情況； 4、采用Caspase-3活性測定法反映大鼠心肌組織中心肌細(xì)胞凋

8、亡發(fā)生情況； 5、用Western—blot法檢測大鼠心肌組織中HIF-1α及iNOS的蛋白表達水平； 6、用real—TimePCR法檢測大鼠心肌組織中HIF-1α及iNOSmRNA的表達水平； 7、采用放射免疫法檢測各組大鼠心肌組織中cGMP含量； 8、利用培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞模擬心肌缺血/再灌注建立缺氧/復(fù)氧及缺氧后處理模型： (1)常氧對照組：置于37℃95％空氣，5％CO2中持續(xù)培養(yǎng)5

9、h； (2)缺氧/復(fù)氧組：置于充滿95％N2和5％CO2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)缺氧培養(yǎng)3h，然后再轉(zhuǎn)入充滿95％空氣，5％CO2的常氧培養(yǎng)箱中復(fù)氧2h； (3)缺氧后處理組：缺氧培養(yǎng)3h后，復(fù)氧5min+缺氧5min，重復(fù)三次，然后再復(fù)氧培養(yǎng)1.5h； (4)DMOG+缺氧后處理：缺氧前在培養(yǎng)液中分別加入不同量的DMOG，使其終濃度分別為0.1mM，0.5mM以及1mM，其余操作同(3)； 9、檢測心肌細(xì)胞存活率

10、(CCK8法)，培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶(LDH)活性變化以及caspase-3活性來反映缺氧/復(fù)氧及缺氧后處理對心肌細(xì)胞的影響； 10、利用RNAi技術(shù)使培養(yǎng)的心肌細(xì)胞HIF-1α基因沉默。 小結(jié)： 1、DMOG使心肌組織中HIF-1α蛋白水平上調(diào)，其上調(diào)程度同后處理的效應(yīng)相同，而給予DMOG后再進行后處理，則可更進一步增加HIF-1α的蛋白表達，提示DMOG與后處理在增加HIF-1α表達方面具有疊加效應(yīng)。給予D

11、MOG并不影響HIF-1αmRNA的表達，說明其是在翻譯后水平上對HIF-1α進行調(diào)節(jié)； 2、DMOG通過上調(diào)HIF-1α蛋白水平減輕了缺血/再灌注導(dǎo)致的心肌損傷，而且更進一步增強了后處理的保護效應(yīng)，表現(xiàn)出DMOG與后處理的疊加效應(yīng)，進一步提示HIF-1α表達上調(diào)與后處理的心肌保護機制可能存在著一定的聯(lián)系； 3、DMOG上調(diào)心肌組織HIF-1α表達，以及增強后處理保護效應(yīng)的同時，心肌組織iNOS表達與cGMP含量均發(fā)生相

12、應(yīng)的增加，提示HIF-1α可能通過其下游iNOS—cGMP通路參與后處理的保護機制； 4、HIF-1α基因沉默后，削弱了后處理對缺氧/復(fù)氧所致心肌細(xì)胞損傷的保護效應(yīng)。 三、后處理可以減輕高脂血癥大鼠心肌缺血/再灌注損傷。 目的： 1、建立食源性高脂血癥大鼠模型，觀察高脂血癥對心肌缺血/再灌注損傷是否具有影響； 2、觀察后處理是否可以影響高脂血癥大鼠缺血/再灌注所致的心肌損傷； 3、觀察高脂

13、血癥對心肌組織中HIF-1α表達的影響。 方法: 1、選取成年Wistar大鼠60只，體重120±10g，隨機平均分為以下兩大組； (1)正常飲食組(N=30)：普通飼料喂養(yǎng)8周，分別隨機分為以下3組：①正常飲食—偽手術(shù)組(N—Sham，n=10)；②正常飲食—缺血/再灌注組(N—Control，n=10)；③正常飲食—缺血后處理組(N-PostC，n=10)。 (2)高脂血癥組(N=30)：高脂飼料喂養(yǎng)

14、8周后鼠尾采血測定血脂水平，隨機平均分為以下3組：①高脂血癥—偽手術(shù)組(HC—Sham，n=10)；②高脂血癥一缺血/再灌注組(HC—Control，n=10)；③高脂血癥—缺血后處理組(HC-PostC，n=10)。 2、采用比色法測定血脂水平； 3、心肌梗死面積測定：采用Evanseblue和TTC雙染法測定心肌梗死面積； 4、測定血清肌酸激酶(CK)的活性來進一步反映心肌損傷情況； 5、采用Casp

15、ase-3活性測定法反映大鼠心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生情況； 6、用Western—blot法檢測大鼠心肌組織中HIF-1α及iNOS的蛋白表達水平； 7、用real—TimePCR法檢測大鼠心肌組織中HIF-1α及iNOSmRNA的表達水平。 小結(jié)： 1、后處理可以減輕高脂血癥大鼠缺血/再灌注造成的心肌損傷； 2、高脂血癥及后處理均可上調(diào)心肌組織中HIF-1α的蛋白水平，后處理減輕高脂血癥大鼠心