紫花苜蓿抗寒基因MsMADS1的克隆及其功能研究.pdf

1、低溫是限制植物的生長(zhǎng)發(fā)育及作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫之一。MADS-box是在植物體內(nèi)研究較為廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生殖起到重要的調(diào)控作用。本研究從紫花苜蓿中克隆得到MsMADS1基因，構(gòu)建其植物表達(dá)載體，并將MsMADS1基因轉(zhuǎn)入模式植物煙草中，研究MsMADS1基因的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.MsMADS1基因的克隆與序列分析
　　根據(jù)肇東苜蓿低溫脅迫下轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列信息設(shè)計(jì)克隆引物，通過RT-PCR方

2、法克隆獲得MsMADS1基因，該基因全長(zhǎng)為741bp，編碼246個(gè)氨基酸。該蛋白含有一個(gè)MADS-box結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)K-box結(jié)構(gòu)域。經(jīng)NCBI protein BLAST分析，發(fā)現(xiàn)MsMADS1與MtMADS-box氨基酸相似性為90％，且在結(jié)構(gòu)域內(nèi)有3個(gè)差異位點(diǎn)。
　　2.MsMADS1基因的表達(dá)
　　通過qRT-PCR的方法，對(duì)MsMADS1基因在肇東苜蓿不同組織及不同非生物脅迫下的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MsMA

3、DS1基因在根、莖、葉、花、果實(shí)中均表達(dá)，但在根中表達(dá)量最高;在不同非生物脅迫下，肇東苜蓿的地上部葉和地下部根中的MsMADS1基因受低溫脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)，并響應(yīng)鹽、鹽堿、干旱和ABA。
　　3.MsMADS1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　構(gòu)建了MsMADS1基因的植物表達(dá)載體PCAMBIA1305.1-MsMADS1，含有CaMV35S啟動(dòng)子和植物潮霉素抗性。
　　4.MsMADS1基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化
　　利用

4、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將MsMADS1基因轉(zhuǎn)入模式植物煙草中，經(jīng)潮霉素(Hyg)篩選共獲得35棵抗性植株。通過PCR的初步鑒定共獲得21株轉(zhuǎn)基因植株。通過qRT-PCR法對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株中的基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株中4號(hào)、18號(hào)和29號(hào)株系中MsMADS1基因的表達(dá)量比較高。
　　5.轉(zhuǎn)MsMADS1基因煙草的抗寒性分析
　　對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行低溫脅迫處理，分析轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒能力。將轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行低溫脅迫處理，野生型