共表達(dá)AsiaⅠ型FMDV P1-2A和3C基因重組山羊痘病毒的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、本文以山羊痘病毒為載體，利用病毒在細(xì)胞內(nèi)的同源重組，以綠色熒光蛋白為篩選標(biāo)記，探索FMDV P1-2A、3C在細(xì)胞中的表達(dá)，使得進(jìn)一步預(yù)測(cè)它們的生物學(xué)特征、應(yīng)用前景及構(gòu)建更多的表達(dá)外源基因的重組GPV變得實(shí)際可行。主要的工作進(jìn)行如下： 1．目的基因的獲得：提取山羊痘病毒溫度敏感弱毒株(YD)DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了2078bp的DNA片段，并將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-Teasy載體。酶切鑒定、PCR

2、鑒定和測(cè)序結(jié)果表明，成功獲得了TK基因，獲得的TK基因內(nèi)存在一個(gè)Kpn I酶切位點(diǎn)和編碼區(qū)的早期轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)TTTTTN(T)T。核苷酸和氨基酸同源性分析表明，弱毒毒株YDTK基因與參考毒株的核苷酸和氨基酸的同源性在95.5％-100.0％之間，說(shuō)明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。 2．轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建：為了在重組GPV中真實(shí)高效地表達(dá)外源基因，將口蹄疫病毒(FMDV)衣殼蛋白前體P1-2A基因和蛋白酶3C基因與啟動(dòng)綠色熒光蛋白

3、雙向串連痘苗病毒啟動(dòng)子相連，為進(jìn)一步構(gòu)建用于轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體提供了包含真核基因表達(dá)元件和篩選標(biāo)記基因的表達(dá)盒。以kpn， I為插入位點(diǎn)，將整體表達(dá)盒插入山羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體骨架pUC119-TK之中，構(gòu)建共表達(dá)重組山羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體pTK-P7.5-GFP-P。 3．重組山羊痘病毒的篩選和鑒定：在構(gòu)建表達(dá)Asia I型FMDV P1-2A和3C基因和含有綠色熒光蛋白基因的重組山羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體pTK-P7.5-GFP-P的基礎(chǔ)上