酶聯(lián)免疫法快速測(cè)定妊娠母馬血清中eCG含量的研究.pdf

1、本研究通過2個(gè)試驗(yàn)制備了抗孕馬血清促性腺激素多克隆抗體(以下簡(jiǎn)稱抗eCG多抗)并研究了eCG多抗免疫檢測(cè)試劑盒。試驗(yàn)一通過選擇標(biāo)準(zhǔn)抗原、免疫兔子及對(duì)多抗進(jìn)行提純及性質(zhì)鑒定，制備出特異性較強(qiáng)的抗eCG多抗，從而為ELISA檢測(cè)提供條件。用辣根過氧化物酶標(biāo)記制備的抗eCG多抗，并對(duì)直接競(jìng)爭(zhēng)法和間接競(jìng)爭(zhēng)法兩種檢測(cè)方法進(jìn)行了初步比較，確定后者為試劑盒方法，從而為試劑盒制作奠定基礎(chǔ)；試驗(yàn)二對(duì)選定的試劑盒檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)條件的優(yōu)化，組裝出eCG多抗

2、免疫檢測(cè)試劑盒，并對(duì)其檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。 試驗(yàn)結(jié)果表明，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)的eCG純度較高，制備的抗eCG多抗效價(jià)也較高，達(dá)10<'5>以上，蛋白含量為23.67 mg/ml，純化后效價(jià)接近4×10<'4>，蛋白含量為8.088 mg/ml，蛋白質(zhì)回收率為47.85％。與促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)進(jìn)行交義反應(yīng)鑒定，發(fā)現(xiàn)其與LH有微弱交叉，而與FSH無交叉反應(yīng)，考慮到LH在體內(nèi)的含量及其微弱，故該多抗可用來做免疫檢測(cè)使

3、用。選擇了間接競(jìng)爭(zhēng)法做為試劑盒的檢測(cè)方法。試劑盒檢測(cè)程序?yàn)椋河脴?biāo)準(zhǔn)抗原液(eCG+CBS(碳酸鹽緩沖液，0.05mol/l，pH 9.6))進(jìn)行包被，包被條件為37℃孵育3h：PBST(PBS(磷酸鹽緩沖液)+吐溫20)洗滌后用0.5％的明膠進(jìn)行封閉，封閉條件為37℃孵育2h；PBST洗滌后加入樣品液和一抗，樣品液為血清樣品+PBS(0.01mol/l，pH 7.4)，一抗為1000倍稀釋的抗eCG多抗，37℃孵育1.5h；；PBST洗

4、滌后加入二抗(羊抗兔)37℃孵育1h；PBST及雙蒸水洗滌后加入底物液，37℃避光反應(yīng)10min，加入終止液(2M H<,2>SO<,4>)終止反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)下，用酶標(biāo)儀讀數(shù)。組裝的試劑盒檢測(cè)樣品效果良好，其檢測(cè)范圍為2.5-20 IU/ml，靈敏度為2.8 IU/ml，板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別為7.2％和14.2％。方法的線性關(guān)系良好(R<'2>=0.9828)。因此，本研究組裝的試劑盒可以用來檢測(cè)妊娠馬血清及eCG制劑。與常