新城疫病毒樣顆粒免疫效力的初步研究.pdf

1、本實驗室采用昆蟲細(xì)胞．桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，已經(jīng)成功獲得了共表達(dá)新城疫病毒 (NewcastleDise2Lse virus，NDV) F<,48>E<,9>株F、HN、NP和M蛋白的重組桿狀病毒rBac-F-HN-NP-M，并證明其感染sf9細(xì)胞后，可以在細(xì)胞表面形成并釋放新城疫病毒樣顆粒 (Newcastle disease Virus-like particles，ND-VLPs)。 為了研究ND-VLPs的免疫原性和免疫效力

2、，本研究采用蔗糖密度梯度離心法純化釋放到細(xì)胞培養(yǎng)上清的VLPs，并對其生物學(xué)特性進行分析。通過wlest鋤blot檢測到培養(yǎng)上清中HN，F(xiàn)，NP，M蛋白的共表達(dá)，同時在負(fù)染電鏡下觀察到表面有纖突的類似NDV的圓形粒子，證明4種蛋白在Sf9細(xì)胞內(nèi)裝配成了VLPs，并以出芽的方式釋放到上清。HA試驗測定VLPs具有很高的凝集雞紅細(xì)胞的能力(10μg純化的VLPs的HA效價為128)，說明HN組裝入ND-VLPs以后，仍然保持血凝素的正確空間

3、構(gòu)象。試驗結(jié)果表明ND-VLPs的分泌高峰是在感染后96h，單位體積(100ml感染上清)產(chǎn)量為1.57mg，4種蛋白的濃度范圍分別為，HN：0.76-1.14μg/10μg VLPs，F(xiàn)：0.38-0.76μg/10μg VLPs，NP：1.14-1.52μg/10μg VLP，M：0.67-0.95μg/10μg VLPs。 我們分別通過肌肉注射(輔以弗氏佐劑)和滴鼻途徑(不加佐劑)，以不同劑量的ND-VLPs(10、20、

4、25μg)免疫18日齡SPF雞，并在首免后2周加強免疫一次，同時設(shè)PBS、NDV疫苗組及NDV疫苗+VLPs聯(lián)合免疫作對照。首免后，監(jiān)測血清中NDV特異性抗體滴度的動態(tài)變化。于二免后兩周以3.16×10<'3>EID<,50>的F<,48>E<,9>株強毒滴鼻攻毒。聯(lián)合免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平顯著高于其它組，提示VLPs具有良好的免疫原性，并可以提高常規(guī)疫苗的免疫效力。經(jīng)肌肉注射途徑免疫雞可以誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的HI、IgO及中和抗體。攻

5、毒后，25μg VLPs實驗組與NDV疫苗組、聯(lián)合免疫組一樣，能夠100﹪抵抗致死劑量的NDV強毒攻擊；經(jīng)滴鼻途徑，免疫雞不僅可以產(chǎn)生較高水平的HI、中和抗體和局部粘膜抗體，還可以產(chǎn)生少量的循環(huán)抗體IgG。25μg ND-VLPs對致死劑量強毒的攻擊也提供了90﹪的保護，說明ND-VLPs能夠刺激機體產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答并具有一定的免疫保護力，但循環(huán)抗體IgG在抵抗強毒攻擊過程中起著重要作用。ND-VLPs作為粘膜免疫抗原仍需要輔以合適的粘