LGR5通過(guò)調(diào)控Wnt-β-catenin通路促進(jìn)肝臟腫瘤的干性.pdf

1、[研究背景及目的]
　　隨著腫瘤在全世界發(fā)病率的提高，人們對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)也逐漸加深。2011年，著名的Weinberg教授提出腫瘤具有十大特征，分別是:自給自足生長(zhǎng)信號(hào)、抗生長(zhǎng)信號(hào)的不敏感、抵抗細(xì)胞死亡、潛力無(wú)限的復(fù)制能力、持續(xù)的血管生成、組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移、避免免疫摧毀、促進(jìn)腫瘤的炎癥、細(xì)胞能量異常和基因組不穩(wěn)定與突變。利用這些特征，研究者們?nèi)ふ蚁鄳?yīng)腫瘤的癌細(xì)胞，并靶向這群具有相應(yīng)特征的細(xì)胞，有助于腫瘤的治療。
　　我國(guó)是肝病

2、大國(guó)，因此肝癌發(fā)病率在我國(guó)居高不下。肝癌包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌，根據(jù)細(xì)胞分型可將原發(fā)性肝癌分為肝細(xì)胞型肝癌(HCC)、膽管細(xì)胞型肝癌(CC)及混合型肝癌(HCC-CC)，大約75％的原發(fā)性肝癌屬于HCC。
　　腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中具有很強(qiáng)增殖能力、表現(xiàn)部分干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，對(duì)腫瘤放化療抗性的產(chǎn)生和腫瘤的復(fù)發(fā)起關(guān)鍵作用。近年來(lái)，在肝癌組織中同樣發(fā)現(xiàn)類似細(xì)胞，并稱之肝癌干細(xì)胞(LCSCs)或肝癌前體細(xì)胞(TICs)。肝癌干細(xì)

3、胞概念的提出，為深入認(rèn)識(shí)肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制及尋找肝癌診治新方法、新策略提供了理論基礎(chǔ)。然而，如何去識(shí)別并靶向這群肝癌干細(xì)胞，其細(xì)胞標(biāo)志物成為近年來(lái)人們研究的熱點(diǎn)。其中，Epcam、CD133和OV6是近年來(lái)被引用較多的肝癌標(biāo)志物。但是，它們對(duì)肝癌干細(xì)胞的標(biāo)記也并非完全特異，這就推動(dòng)了人們對(duì)肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的進(jìn)一步研究和探索。
　　LGR5(leucine-rich repeat containing G protein-couple

4、d receptor5)，全稱為富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5，又名GPR49。它含有107個(gè)氨基酸，7次跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于糖蛋白受體家族，是最新發(fā)現(xiàn)的Wnt信號(hào)通路的目標(biāo)基因。研究證實(shí)LGR5是多種組織的干細(xì)胞標(biāo)記物，并且和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。LGR5在多種瘤體組織中的過(guò)表達(dá)揭示了LGR5與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，尤其在大腸癌中，研究證實(shí)LGR5陽(yáng)性的惡性腫瘤細(xì)胞代表了腫瘤干細(xì)胞，隨之，LGR5作為大腸癌的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物

5、得到廣泛應(yīng)用。然而，LGR5在肝臟及其腫瘤中的表達(dá)情況和具體功能還鮮為人知?；诖搜芯炕A(chǔ)，提出LGR5在部分肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，并通過(guò)Wnt信號(hào)通路調(diào)控此群細(xì)胞的成瘤能力，使其發(fā)揮肝癌干細(xì)胞的作用。
　　[實(shí)驗(yàn)方法]
　　1.建立大鼠肝前體細(xì)胞活化模型，利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠肝臟前體細(xì)胞中LGR5的表達(dá)情況;選取肝癌樣本組織，利用免疫組織芯片方法檢測(cè)人肝癌組織中LGR5的表達(dá);
　　2.選取大鼠，建立DEN誘癌模

6、型，利用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)誘癌過(guò)程不同時(shí)間點(diǎn)LGR5蛋白和RNA表達(dá)水平;
　　3.利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞表面LGR5比例;利用免疫磁珠分選技術(shù)將肝癌細(xì)胞系分選為L(zhǎng)GR5陽(yáng)性和陰性肝癌細(xì)胞群，比較兩者功能學(xué)差異。
　　4.構(gòu)建LGR5質(zhì)粒并導(dǎo)入慢病毒載體，慢病毒感染肝癌細(xì)胞，構(gòu)建LGR5穩(wěn)定過(guò)表達(dá)細(xì)胞系;設(shè)計(jì)LGR5干擾序列，構(gòu)建相應(yīng)慢病毒載體并感染肝癌細(xì)胞，建立LGR5干擾細(xì)胞系;

7、　　5.利用免疫組織化學(xué)、組織免疫熒光等方法檢測(cè)組織中LGR5與其他肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的共定位情況;
　　6.利用Sphere成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)LGR5的表達(dá)與成球能力的關(guān)系;利用RT-PCR檢測(cè)LGR5的表達(dá)與干性基因表達(dá)的關(guān)系;
　　7.建立NOD/SCID鼠皮下荷瘤模型，檢測(cè)細(xì)胞中LGR5表達(dá)的高低、LGR5陽(yáng)性細(xì)胞與陰性細(xì)胞是否與體內(nèi)成瘤能力強(qiáng)弱相關(guān);
　　8.利用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)LGR5

8、與Wnt通路靶基因的關(guān)系、β-catenin蛋白水平變化;
　　9.利用Western blot和免疫共沉淀探討LGR5與β-catenin降解復(fù)合體之間的關(guān)系。
　　[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　1.LGR5在大鼠肝前體細(xì)胞中高表達(dá);在大鼠DEN誘癌過(guò)程中，相比對(duì)照LGR5明顯高表達(dá)，提示LGR5促進(jìn)肝癌的發(fā)生;
　　2.18對(duì)人肝癌組織中LGR5在癌組織的表達(dá)高于癌旁組織，8對(duì)組織中癌旁高于癌;且LGR5在不同個(gè)體中的癌

9、組織之間、癌旁組織之間高低表達(dá)不同，提示LGR5在人肝癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)差異性;
　　3.相比LGR5陰性肝癌細(xì)胞，LGR5陽(yáng)性肝癌細(xì)胞的干性相關(guān)基因呈高表達(dá)，體內(nèi)成瘤能力增強(qiáng)，且在人肝癌組織中LGR5與OV6有良好的共定位關(guān)系，提示LGR5陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性;
　　4.相比對(duì)照肝癌細(xì)胞，過(guò)表達(dá)LGR5的肝癌細(xì)胞系呈現(xiàn)干性基因表達(dá)上調(diào)、成球能力及體內(nèi)成瘤能力增強(qiáng)，提示在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LGR5可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的

10、干細(xì)胞特性;
　　5.相比對(duì)照肝癌細(xì)胞，干擾LGR5肝癌細(xì)胞系呈現(xiàn)干性基因表達(dá)下調(diào)、成球能力及體內(nèi)成瘤能力減弱，提示在肝癌細(xì)胞中干擾LGR5可減弱肝癌細(xì)胞的成瘤性;
　　6.10種肝癌細(xì)胞系中LGR5與β-catenin表達(dá)呈現(xiàn)相關(guān)性，LGR5高表達(dá)的肝癌組織樣本中β-catenin也呈現(xiàn)高表達(dá)，在過(guò)表達(dá)LGR5的肝癌細(xì)胞中，β-catenin降解速度減慢，Wnt下游靶基因表達(dá)上調(diào)，與β-catenin結(jié)合的GSK-3β減少

11、，入核的β-catenin增多;在干擾LGR5細(xì)胞系中，β-catenin降解速度增加，Wnt下游靶基因表達(dá)下調(diào)，在GSK-3β抑制劑作用時(shí)β-catenin的增加明顯弱于對(duì)照，反映β-catenin入核的熒光素酶活性明顯減弱;提示LGR5通過(guò)增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性促進(jìn)肝癌發(fā)展;
　　7.56對(duì)樣本組織中，高表達(dá)LGR5組的無(wú)瘤生存率、總生存率均低于LGR5低表達(dá)組，提示LGR5與肝癌的不良預(yù)后相關(guān)。