HIF-1α小型干擾RNA抑制泡沫細胞形成及洛伐他汀對HIF-1α表達影響的體外研究.pdf

1、研究背景：氧化修飾低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OX-LDL是引起動脈粥樣硬化的重要物質，越來越多的證據表明，氧化應激、巨噬細胞大量攝取OX-LDL及泡沫細胞形成可導致內皮功能紊亂，動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)形成。 AS炎癥學說認為AS是一個慢性炎癥過程，在諸多引起內皮損傷的有害刺激中，OX-LDL起關鍵作用。文獻報道在正常氧條件下OX-LDL是通過氧化

2、還原調節(jié)途徑引起人巨噬細胞缺氧誘導因子-1a (hypoxia-inducible factor-1a,HIF-1a)蛋白積累，提示HIF-1 a可能在AS和OX—LDL所致的病理狀態(tài)中起作用。HIF-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)在髓系細胞介導的炎癥中是必需的，是炎癥細胞功能的關鍵調節(jié)因子。HIF-1是由α亞基和β亞基組成的異二聚體，其中HIF-1a蛋白是HIF-1DNA結合活性的主要決定因素，

3、為具有廣泛作用的重要調節(jié)因子。因此，抑制HIF-1a表達將是研究HIF-1a依賴動脈硬化進程，干擾缺氧誘發(fā)病理改變的關鍵環(huán)節(jié)之一。 方法：HIF-1a型干擾RNA(HIF-1a-siRNA)被認為是研究HIF-1a相關信號轉導和缺氧誘發(fā)生理變化的最好工具。本研究將HIF-1a-siRNA加入人單核細胞株系U937細胞中，采用油紅染色檢測泡沫細胞的形成，并用基因芯片法來觀察OX-LDL刺激后對巨噬細胞基因表達變化，根據基因芯片檢測

4、結果，用Real—timePCR驗證了與AS密切相關的6種基因及HIF-1amRNA的表達，用Western blot驗證了與AS密切相關的4種基因及HIF-1a蛋白的表達。同時采用Real-time PCR及Western blot來檢測洛伐他汀(10vastatin)對HIF-1a表達的影響。 結果：正常巨噬細胞不含高濃度脂肪滴，因此不會被特異性脂肪滴染料油紅染色。培養(yǎng)的U937細胞及HIF-1a-siRNA轉染載體I轉染的

5、U937細胞分別用40mg/L OX-LDL刺激，24 h后進行油紅染色。結果顯示：未加OX-LDL刺激的U937細胞未見泡沫細胞形成；正常U937細胞加入ox-LDL刺激24 h后，全部轉化為泡沫細胞；HIF-1a-SiRNA轉染載體I轉染的u937細胞加TY 入OX-LDL刺激24 h后，雖有部分泡沫細胞形成，但其形成量顯著低于未轉染組?；蛐酒Y果顯示：用OX-LDL刺激后，與動脈硬化相關的96個基因中，有70個上調；在進行HIF

6、-1a-siRNA干擾后，這70個基因中，有57個下調。 Real-time PCR結果顯示：在培養(yǎng)的U937細胞中，加入40mg/L OX-LDL可引起細胞間粘附分子-l (intercellular adhesion molecule-1，ICAMl)、血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAMl)、血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體(lectin-like OX-LDL r

7、eceptor,LOXl)、環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2.COX-2)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、低密度脂蛋白受體(LDL receptor,LDLR)及HIF-1amRNA表達顯著升高，而用HIF-1a-siRNA預處理過的細胞加入OX-LDL，其表達與單純OX-LDL組相比顯著下調(P<0.05)，該結果與基因芯片結果一致。 Western blot結果顯示:在培養(yǎng)的U9

8、37細胞中，加入40mg/L OX-LDL可引起ICAM1、VCAM1、COX-2、IL-1β及HIF-1a蛋白的表達顯著升高，而用HIF-1a-siRNA預處理過的細胞加入OX-LDL，其表達與單純OX-LDL組相比顯著下調(P<0.05)，該結果與基因芯片結果一致。 洛伐他汀與培養(yǎng)的巨噬細胞U937共孵育，用40 mg/L OX-LDL刺激細胞，觀察藥物對細胞HIF-1a表達的影響。結果顯示：OX-LDL刺激下，U937細胞

9、中HIF-1a表達量顯著升高，加入洛伐他汀后，HIF-1 a的表達量顯著降低，隨劑量增加，抑制作用顯著增強，有明顯的劑量依賴關系。Western blot結果與Real-time PCR結果相似。 結論：OX-LDL氧化損傷導致巨噬細胞HIF-1a高表達，是促進泡沫細胞形成的關鍵步驟；HIF-1a-siRNA可通過抑制HIF-1a表達來調控與AS相關基因的表達，從而抑制泡沫細胞的形成；洛伐他汀可抑制巨噬細胞HIF-1a的表達。