柞蠶類serpin-1基因的鑒定與功能分析.pdf

1、柞蠶(Antheraea pernyi)最早在中國(guó)山東地區(qū)發(fā)現(xiàn)并開始養(yǎng)殖馴化，是我國(guó)重要的一類野生絹絲昆蟲。絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)在昆蟲的先天免疫中通過與絲氨酸蛋白酶相互制約達(dá)到一定的動(dòng)態(tài)平衡，從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)很多的生命活動(dòng)，在昆蟲的先天免疫中發(fā)揮重要的作用。本文主要研究serpin-like基因的表達(dá)模式和在柞蠶先天免疫中的功能，研究結(jié)果如下:
　　本研究利用PCR技術(shù)成功克隆并獲得一個(gè)讀碼框?yàn)?37bp的serpi

2、n-1like基因，其含有一個(gè)保守的serpin結(jié)構(gòu)域，進(jìn)化樹分析顯示其與印度柞蠶親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)為82.1％。
　　通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-Ap-serpin-like，并經(jīng)不同濃度IPTG誘導(dǎo)成功獲得了重組pET-28a-Ap-serpin-1like蛋白。大量誘導(dǎo)后使用蛋白純化柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，得到濃度和純度都非常高的pET-28a-Ap-serpin-1like蛋白，蛋白濃度約為0.5mg/ml。以

3、獲得的重組蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔，通過實(shí)驗(yàn)室常規(guī)取血方法取血得到Ap-serpin-1like抗體并檢測(cè)效價(jià)約為1∶128000。
　　利用PCR技術(shù)和Western Blot實(shí)驗(yàn)操作方法檢測(cè)serpin-llike基因在柞蠶五齡三天幼蟲的血淋巴、表皮、絲腺、脂肪體、中腸和馬氏管中的表達(dá)情況，結(jié)果表明Ap-serpin-like在柞蠶中屬于組成性表達(dá)，在脂肪體中表達(dá)最高，在血淋巴中表達(dá)量最低。
　　同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量PCR

4、技術(shù)檢測(cè)柞蠶不同發(fā)育階段serpin-1like基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)serpin-1like在蛹期表達(dá)量最高，在四齡時(shí)候表達(dá)量低，其他幾個(gè)齡期表達(dá)差異不顯著。
　　隨后研究了在四種病原微生物刺激下柞蠶五齡三天幼蟲免疫功能所受到的影響。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)脂肪體、血淋巴和中腸中Ap-serpin-like基因在病原微生物刺激后的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在三種組織中都能明顯上調(diào)或下調(diào)Ap-serpin-like的表達(dá)。

5、r>　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):在脂肪體中，Ap-serpin-1like除了注射B.bassiana在24-48h下調(diào)之外，其他三種菌的各個(gè)時(shí)間段均表達(dá)量上調(diào)，但各時(shí)間段上調(diào)程度有所不同。在血淋巴中，注射B.bassiana和M.luteus，Ap-serpin-1like mRNA表達(dá)量在24h達(dá)到最高，而注射E.coli在第一個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)1.5h的時(shí)候表達(dá)量高于其他的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。柞蠶的中腸中，表達(dá)情況是有所不同的:注射B.bassiana對(duì)柞蠶

6、刺激后，Ap-serpin-1like mRNA在48h表達(dá)明顯高于其他的時(shí)間段。注射NPV后Ap-serpin-like在24h表達(dá)水平達(dá)到最高。M.luteus誘導(dǎo)后，Ap-serpin-like的轉(zhuǎn)錄水平在1.5h表達(dá)量最高。而注射E.coli對(duì)Ap-serpin-1like mRNA表達(dá)影響較小。
　　綜上所述，Ap-serpin-1like在柞蠶的先天性免疫應(yīng)答中可能有重要的作用和功能，本研究可以為進(jìn)一步從分子水平上解釋