Hippo通路主要組分與小鼠原始卵泡池大小的時序相關(guān)性研究.pdf

1、背景及目的:
　　闡明原始卵泡啟動的分子機制對于防治女性不孕癥和卵巢早衰具有重要意義。最近研究表明,卵巢皮層密度變化能觸發(fā)原始卵泡的啟動,而在果蠅中的研究顯示由多個癌基因(Mst/Lats/Yap)參與的Hippo信號通路可感知卵巢細(xì)胞密度的變化。本課題探究Hippo通路主要組份MST、LATS、YAP與小鼠原始卵泡池大小的時序相關(guān)性以及原始卵泡啟動前后的表達(dá)變化,為進(jìn)一步了解卵巢的功能及其調(diào)控機理增添新資料。
　　方法:<

2、br>　　1.利用Western blot、Real-time PCR及免疫組化等方法檢測出生后3d、1m、5m及16m等不同月齡小鼠卵巢中mst、lats和yap mRNA及蛋白的表達(dá)變化及定位,分析Hippo信號通路主要組分與原始卵泡池大小的時序相關(guān)性。
　　2.建立小鼠原始卵泡體外培養(yǎng)模型,利用Western blot、Real-time PCR及免疫組化等方法檢測mst、lats和yap mRNA及蛋白在原始卵泡啟動前后表

3、達(dá)變化。
　　3.利用Western blot檢測原始卵泡啟動前后及卵泡發(fā)育過程中P-YAP蛋白表達(dá)變化,分析P-YAP/YAP比值變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.Western blot結(jié)果顯示:MST蛋白以3d組含量最高,此后隨著月齡的增長,MST含量顯著減少(p<0.05),但1m、5m、16m三組之間表達(dá)并無顯著性差異(p>0.05);LATS蛋白表達(dá)亦呈現(xiàn)與MST的變化趨勢(p<0.05,p<0.01,p<0

4、.05),但16m與5m相比較卻顯著增多(p<0.05);YAP蛋白表達(dá)以3d組最低,此后1m、5m、16m組顯著升高(p<0.05,p<0.01,p<0.01),而16m與5m組比較顯著減少(p<0.05)。P-YAP蛋白表達(dá)與3d組相比,1m、5m、16m均顯著增多(p<0.05),但1m、5m、16m三組之間表達(dá)無顯著性差異(p>0.05);隨著月齡增加,P-YAP/YAP比值均顯著減少(p<0.05),但16m與5m組比較無顯著

5、性差異(p>0.05)。
　　2. Real-time PCR結(jié)果顯示:隨著小鼠月齡的增長,mst、lats mRNA表達(dá)均表現(xiàn)為3d最多,此后逐漸減少(p<0.05,p<0.01,p<0.01),然而16m組表達(dá)顯著高于5m組(p<0.05);yap mRNA表達(dá)3d最少,此后極為顯著增多,(p<0.01, p<0.001,p<0.01),但16m組表達(dá)顯著低于5m組(p<0.05)。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示:MST、L

6、ATS、YAP在原始卵泡中均主要分布于卵母細(xì)胞質(zhì)中,在初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡的卵母細(xì)胞質(zhì)、卵周膜及顆粒細(xì)胞中均有表達(dá),且在次級卵泡中強表達(dá)于顆粒細(xì)胞,在閉鎖卵泡中則少表達(dá)或無表達(dá)。此外,P-YAP亦表達(dá)于卵巢卵泡中,在原始卵泡的卵母細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá),在初級卵泡、次級卵泡及成熟卵泡中主要分布于卵母細(xì)胞質(zhì)、卵周膜和顆粒細(xì)胞,在閉鎖卵泡中主要分布于顆粒細(xì)胞中。
　　4.3日齡小鼠卵巢體外培養(yǎng)8天后,HE染色結(jié)果顯示原始卵泡大量啟動發(fā)

7、育為初級卵泡,Western blot及免疫組化結(jié)果均顯示PCNA蛋白表達(dá)顯著增加(p<0.05),提示小鼠原始卵泡Waymouth體外培養(yǎng)體系成功建立。
　　5.利用Western blot及Real-time PCR檢測原始卵泡啟動前后MST、LATS、YAP表達(dá)量變化,結(jié)果顯示:mst mRNA及蛋白表達(dá)均顯著減少(p<0.05);lats mRNA及蛋白表達(dá)均顯著減少(p<0.05);yap mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增多(