黑根霉胞外多糖的分離純化及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、惡性腫瘤是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的一個(gè)主要原因，全球每年約有760萬(wàn)人死于癌癥，并且死亡人數(shù)逐年增加。目前，癌癥的治療主要以手術(shù)、化療和放療為主。大多數(shù)療藥物在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也損害了大量正常細(xì)胞，有很強(qiáng)的毒副作用。因此，尋找更為有效的、副作用小的腫瘤治療藥物日趨重要。近年來(lái)，許多對(duì)機(jī)體毒性反應(yīng)低、并能增加化療藥物敏感性，具有新型化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗腫瘤的有效成分和活性物質(zhì)已經(jīng)從天然產(chǎn)物中篩選和分離出來(lái)。真菌多糖廣泛存在于真菌的子實(shí)體、菌絲體以及發(fā)酵

2、培養(yǎng)液中，并被證明具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖等多種生物活性，尤其在抗腫瘤方面，真菌多糖可通過(guò)損傷腫瘤細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　 黑根霉(Rhizopus nigricans)是一種接合菌類(lèi)絲狀真菌，由于黑根霉具有生物轉(zhuǎn)化的功能，并且能夠產(chǎn)生有機(jī)酸而被廣泛用于化工與制藥行業(yè)。本論文從黑根霉發(fā)酵液中提取并分離得到胞外粗糖EPS，經(jīng)過(guò)離子交換層析以及凝膠過(guò)濾層析純化得到兩種胞外多糖，分別命名為

3、EPS1-1、EPS-2，并對(duì)兩種多糖的純度及一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步解析;研究胞外多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，并初步探討其抑制腫瘤的作用機(jī)制。
　　 1.黑根霉胞外多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)解析
　　 發(fā)酵液去菌絲后經(jīng)濃縮，醇沉、除蛋白、脫色后得到粗多糖EPS。粗多糖經(jīng)DEAE-Fast Flow陰離子交換層析后獲得兩個(gè)組分EPS-1、EPS-2，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)Sephadex G-100以及SephadexG-75凝膠層析純化后，獲得兩

4、個(gè)純化組分命名為EPS1-1、EPS-2。苯酚硫酸法確定EPS1-1、EPS-2含糖量分別為96.8％和82.7％;理化性質(zhì)分析EPS1-1不含淀粉、蛋白質(zhì)和糖醛酸，EPS-2不含淀粉、蛋白質(zhì)但含有少量糖醛酸。
　　 高效凝膠滲透色譜確定EPS1-1、EPS-2組分均一，分子量分別為9682 Da和1.979×105 Da。單糖組成分析表明EPS1-1主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及果糖組成，摩爾比例為:5.89∶3.64∶3.

5、2∶1;EPS-2主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖組成，摩爾比例為:17.8∶2.3∶1。紅外光譜及核磁共振分析分析兩種多糖具有多糖的特征吸收峰，均為β型糖苷為主的吡喃型糖。甲基化分析表明EPS1-1主要以→6)Glcp(1→方式連接。
　　 2.黑根霉胞外多糖抗腫瘤活性研究
　　 MTT法檢測(cè)兩種多糖對(duì)K562、HCT-116、Hela細(xì)胞的抑制率，結(jié)果顯示EPS1-1對(duì)K562和HCT-116細(xì)胞均有明顯抑制作用，且抑

6、制效果呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性;800μg/mL的EPS1-1對(duì)HCT-116細(xì)胞抑制率最大，達(dá)36.1％，對(duì)Hela細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用。EPS-2抑制HCT-116細(xì)胞增殖作用明顯，最高抑制率為40.5％，對(duì)其他兩種細(xì)胞無(wú)明顯抑制作用。
　　 采用Hoechst33258染色方法觀察不同濃度EPS1-1處理腫瘤細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)一致，染色均勻，呈現(xiàn)出微弱的藍(lán)色熒光，處理組細(xì)胞核呈現(xiàn)致密的顆粒狀藍(lán)色熒光;PI染

7、色以及Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果表明EPS1-1處理HCT-116細(xì)胞24h時(shí)，S期細(xì)胞由13.4％增加到22.5％;在100-4001μg/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著EPS1-1濃度升高，發(fā)生早期凋亡的HCT-116逐漸增多，當(dāng)400μg/ml濃度處理時(shí)，達(dá)到了20.8％;表明了EPS1-1誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞周期停滯在S期并發(fā)生了早期凋亡。
　　 分別通過(guò)JC-1染色和DCFH-DA熒光探針研究線粒體膜電位和細(xì)

8、胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPS1-1處理組誘導(dǎo)線粒體膜電位下降（綠色熒光增強(qiáng)），400μg/mL EPS1-1處理組ROS產(chǎn)生量比對(duì)照組高2.75倍。RT-PCR方法檢測(cè)EPS1-1對(duì)HCT-116細(xì)胞p53，Bcl-2，Bax基因表達(dá)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl-2的mRNA表達(dá)量隨著處理濃度的升高不斷降低，而p53和Bax的mRNA表達(dá)量升高;綜上所述，EPS1-1通過(guò)線粒體內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116發(fā)生凋亡。