飲用水中病毒濃縮及檢測(cè)方法的研究和應(yīng)用.pdf

1、由人糞便排入環(huán)境中的病毒已達(dá)140多種血清型,可導(dǎo)致胃腸炎、肝炎、發(fā)熱、腦膜炎、心肌炎等疾病,嚴(yán)重威脅到人類健康。這些病毒在胃腸道復(fù)制,主要通過(guò)糞口途徑傳播,是導(dǎo)致水源性疾病的一個(gè)重要原因。近年來(lái)屢見(jiàn)飲水受到腸病毒污染引起腸道傳染病爆發(fā)的報(bào)道。飲用水安全與人們的生產(chǎn)生活息息相關(guān),其病毒學(xué)安全性應(yīng)該引起學(xué)界與有關(guān)管理部門(mén)高度重視。
　　許多國(guó)家都采用糞便污染指示菌來(lái)評(píng)價(jià)水體的衛(wèi)生微生物學(xué)質(zhì)量包括病毒污染狀況。研究發(fā)現(xiàn)水環(huán)境的細(xì)菌學(xué)水

2、平和病毒濃度之間無(wú)明顯相關(guān),同時(shí)病毒對(duì)外界環(huán)境和消毒作用的抵抗力更強(qiáng),在滿足水體細(xì)菌學(xué)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的情況下仍能檢測(cè)到病毒。因此目前各國(guó)普遍采用的指示菌不能準(zhǔn)確反映水中病毒學(xué)安全性。直接對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)可以提供更可靠的水體病毒污染信息,進(jìn)一步確保用水安全。但是,迄今國(guó)內(nèi)外尚未制定飲水病毒學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和統(tǒng)一可行的水中病毒學(xué)檢測(cè)方法,根本原因在于其技術(shù)難度高、費(fèi)用昂貴、工作量大,涉入門(mén)檻高,基礎(chǔ)科研數(shù)據(jù)積累少。嚴(yán)重制約了飲用水病毒學(xué)研究在國(guó)內(nèi)的開(kāi)展。因此

3、,本研究將從新材料、新配方、新的分子生物學(xué)檢測(cè)法多角度,探索建立可靠、有效的飲用水中病毒濃縮、檢測(cè)方法,并在制水生產(chǎn)實(shí)踐中檢驗(yàn)諸方法應(yīng)用效果。
　　僅就技術(shù)而言,首先環(huán)境水體中病毒濃度遠(yuǎn)比臨床病人感染樣本低,如果特指可能存在于飲用水中的病毒,兩者相差最大可達(dá)1017數(shù)量級(jí)。采用最靈敏的臨床檢測(cè)方法也無(wú)法對(duì)飲水中病毒進(jìn)行檢測(cè)。因此,欲開(kāi)展飲用水病毒學(xué)研究,必須面對(duì)水中病毒濃縮技術(shù)與設(shè)備的挑戰(zhàn)。目前濃縮水中病毒的方法有:微孔濾膜吸附法

4、、硅藻土吸附法、氫氧化鋁吸附沉淀法等。但因?yàn)椴馁|(zhì)和材料物理化學(xué)性質(zhì)、洗脫液性質(zhì)、操作流程不同,導(dǎo)致各種濃集方法最終結(jié)果相差懸殊,使不同國(guó)家與地區(qū)結(jié)果缺乏可比性,難以統(tǒng)一,因此迫切需要探索建立一種高效、靈敏和簡(jiǎn)捷的濃縮方法。本研究在此方面進(jìn)行了初步嘗試,對(duì)比了國(guó)產(chǎn)微孔濾膜與進(jìn)口NanoCeram濾芯初次濃縮病毒的效率。NanoCeram濾芯是一種新型的正電濾芯,因此國(guó)外相關(guān)實(shí)際應(yīng)用的報(bào)道也相對(duì)較少。濾芯的表面積大500至600m2/g,能

5、夠?qū)Σ煌瑵岫鹊拇篌w積水樣進(jìn)行有效濃縮,不需調(diào)節(jié)水樣的pH等處理,可直接進(jìn)行濃縮,操作過(guò)程簡(jiǎn)單,且價(jià)格僅為1MDS濾芯的1/5。本研究首次在國(guó)內(nèi)將此濾芯應(yīng)用于實(shí)際水樣病毒的濃縮,所獲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為國(guó)內(nèi)今后利用該濾芯提供了良好的參考依據(jù)。
　　研究水中病毒的第二個(gè)技術(shù)難點(diǎn)在于,操作步驟繁雜,第一次濃縮后并不能直接檢驗(yàn)病毒,必須再進(jìn)行第二次濃縮,使其最終體積縮小到類似于臨床標(biāo)本體積。第二次濃縮方法有,絮凝沉淀、透析、超速離心等,由于待濃縮樣

6、本體積仍然較大,后兩種方法不太實(shí)用,主要采用絮凝沉淀法。絮凝劑有無(wú)機(jī)絮凝劑和有機(jī)絮凝劑,種類繁多,理化性質(zhì)各異,尋找理想滿意的絮凝劑,需要具體問(wèn)題具體分析,開(kāi)展細(xì)致篩選研究。本研究探討了3種不同絮凝劑在二次濃縮中的最佳條件與效果,有機(jī)絮凝劑聚乙二醇擇優(yōu)而出。
　　濃縮過(guò)程結(jié)束,僅僅類似于完成了臨床標(biāo)本的采集,隨之相應(yīng)的除菌、選擇敏感宿主接種樣本,觀察病毒復(fù)制接踵而至。但是,環(huán)境中病毒與臨床檢驗(yàn)巨大不同處是其多樣性,一個(gè)患者一般情況

7、下只感染一種病毒,其實(shí)驗(yàn)室敏感宿主細(xì)胞范圍較窄,容易確定?？墒?環(huán)境水體中濃縮的病毒,可能為一種,也可能有多種數(shù)十種,不同病毒有其特定的敏感宿主,這為最終檢測(cè)環(huán)境病毒帶來(lái)極大的工作量。另外,有的病毒不能用細(xì)胞檢測(cè),例如,諾如病毒,或有些病毒對(duì)細(xì)胞不敏感,例如,腺病毒 F組40、41血清型,這為檢測(cè)環(huán)境病毒帶來(lái)極大不確定性。若要解決以上問(wèn)題,只能從分子生物學(xué)領(lǐng)域借助工具,基因探針和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)似乎能夠同時(shí)解決以上難題,但是基因探

8、針因其靈敏度太低,已被淘汰,而最新的熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)視乎可彌補(bǔ)上述所有不足。熒光定量PCR可對(duì)模板進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),精確對(duì)起始模板進(jìn)行定量,且檢測(cè)時(shí)間短,從病毒核酸提取到熒光定量PCR完成僅僅需要4～5小時(shí),熒光定量PCR檢測(cè)范圍寬,靈敏度高,特異性強(qiáng),顯示其在環(huán)境病毒學(xué)檢測(cè)中的巨大優(yōu)勢(shì)。盡管如此,對(duì)于具體的每一種病毒,qPCR技術(shù)并非唾手可得,針對(duì)不同病毒,其保守區(qū)引物設(shè)計(jì),內(nèi)標(biāo)構(gòu)建,擴(kuò)增產(chǎn)物特異性、檢測(cè)方法的靈敏度等,都需

9、要探索研究。本研究針對(duì)不易培養(yǎng)的腺病毒 F組40、41血清型、培養(yǎng)難度較大的A群輪狀病毒及具有普遍意義的整個(gè)腸道病毒屬,構(gòu)建了相應(yīng)的熒光定量PCR方法,成功實(shí)現(xiàn)對(duì)自來(lái)水廠水樣中相應(yīng)病毒的檢測(cè)。
　　國(guó)外研究顯示病毒普遍存在于各種水體,例如江、河、湖、海、地下水,乃至經(jīng)過(guò)凈化處理過(guò)的自來(lái)水都含有一定量的病毒。國(guó)內(nèi)有研究人員檢測(cè)了渤海中腸道病毒的污染情況,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)海水中腸道病毒濃度范圍為6.3×107拷貝/L至1.7×106拷貝/L,

10、何等僅僅采集了2L水樣,發(fā)現(xiàn)輪狀病毒在北京水源水中的檢出率為34.6％,出廠水中的檢出率為11.7％,末梢水中的檢出率為22.4％。二十年前,張楚瑜等人對(duì)武漢東湖水廠腸道病毒進(jìn)行檢測(cè),原水病毒濃度均值為14.31PFU/L,陽(yáng)性率為60％,出廠水濃度均值為6.7PFU/L,陽(yáng)性率為35％,水廠水處理工藝對(duì)腸道病毒的去除率為53.18％。當(dāng)時(shí)東湖是武漢武昌區(qū)的主要飲用水水源,然而隨著東湖水污染的日益加重,最后不得不放棄將其作為飲用水水源,

11、改用長(zhǎng)江水為唯一飲用水水源。武漢市是長(zhǎng)江與漢江匯聚的大都市,武漢受惠于兩江,但也可能遭受其害。原因在于,隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)突飛猛進(jìn)的發(fā)展,長(zhǎng)江、漢江環(huán)境污染負(fù)荷日益加重,有報(bào)道,僅2007年一年長(zhǎng)江就接受了300多億噸廢水。武漢有關(guān)部門(mén)最新公布資料,在武漢的18各水源保護(hù)地附近就有15處污水排放口,直接威脅到自來(lái)水廠取水安全。人們有理由為自己飲水的化學(xué)安全性、生物學(xué)安全性擔(dān)心。但是,有關(guān)利用長(zhǎng)江與漢江作為水源的各自來(lái)水廠原水、出廠水是否存在病

12、毒污染,其變化規(guī)律如何,一直是有待解開(kāi)的迷。不僅如此,整個(gè)長(zhǎng)江流域200多個(gè)大中小城市,甚至全國(guó)縣以上4000多個(gè)水廠也幾乎很少開(kāi)展飲水病毒學(xué)研究。這種狀況與國(guó)際上同類研究差距甚遠(yuǎn),無(wú)論從學(xué)術(shù)上還是從生產(chǎn)實(shí)踐中都需要急起直追。本研究對(duì)武漢市兩江共6個(gè)自來(lái)水廠病毒污染狀況開(kāi)展了一年四季的監(jiān)測(cè)調(diào)查,比較了出廠水與原水中腺病毒、輪狀病毒和腸道病毒的污染水平與去除率,考察了糞便污染指示菌、有關(guān)重要理化指標(biāo)與病毒滅活的關(guān)系,對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行了科學(xué)謹(jǐn)